Institut für Biologie

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    Publication
    Analysis of the structure of tomato mosaic virus movement protein based on virus host interactions
    (2011) Tanwir, Fariha; Pfitzner, Artur J. P.
    Viruses are obligatory plant pathogens causing sever diseases, and ultimately great losses in crop yield. Plant viruses, once entered in the cell, make use of host machinery for its own replication and moves from one cell to the other. Natural resistance against virus attack is achieved by the presence of resistance genes (R genes). R genes recognize viral avirulence (Avr) factors in elicitor-receptor manner to initiate resistance cascade. In tomato, the resistance genes Tm-I, Tm-2 and Tm-22 are used to protect the plants against infection by tomato mosaic virus.Tm-2 and Tm-22 require recognition of the viral 30kDa movement protein (MP) for triggering resistance response. Sequence analysis of Tm-2 and Tm-22 resistance breaking viruses have shown an amino-acid exchange at position 133 (E>K) is found in all Tm-2 resistance breaking virus strains, whereas, amino-acid exchange at position 130 (K>E) is associated with Tm-22 resistance breaking phenotype (Calder and Palukaitis, 1992). This suggests a physical interaction between resistance genes and 30kDa MP. In the present study, a unique Split GFP approach is used to analyse the structure and localization of different domains of 30kDa MP in S. cerviceae and N. benthamiana. Different deletion mutants were fused between two non-overlapping halves of GFP and expressed. Results showed that both N and C terminus as well as the middle part of 30kDa MP (aa 80-150) is present in the cytoplasm with two integral membrane loops. These findings are in contrast with previous in-vitro results, which suggest that middle part of 30kDa MP is present in ER lumen, whereas N and C terminus in cytoplasm (Brill et al., 2000). Fluorescence microscopy revealed that GFP fused 30kDa MP deletion mutants were localized on the cytoplasmic side of plasmamembrane and near plasmodesmata. Membrane association of fusion protein confirmed the proper folding and functionality of deletion mutants. Therefore, the structural model of ToMV 30kDa MP has to be revised. Secondly, to identify the host factors involved in resistance mechanism, initiated by Tm-2 and Tm-22 resistance genes, tomato mosaic virus based vectors were constructed. Two different types of in-vivo transcription vectors were constructed, one containing both right and left border of the T-DNA (pBinSLN) and one without the right border (pBinSLN-RB). Self replication of these vectors were analysed in N. benthamiana, N. tabacum and S. lycopersicum. It was found that the deletion of RB does not affect virus replication, when agro-infiltrated in N. benthamiana. pBinSLN-RB was used further for the isolation of a stable and vigorous Tm-2 and Tm-22 resistance breaking ToMV strain through a novel selection scheme. ToMV2-22 contains two amino-acid exchanges at position 54(N>D) and 133(E>K). ToMV2-22 is the first mutant strain of ToMV, which can escape both Tm-2 and Tm-22 resistance simultaneously.
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    Publication
    Recombinant production and characterization of metalloproteins from bacterial pathogens and the innate immune response
    (2024) Göbel, Katharina; Fritz, Günter
    The challenges and potential solutions of drug development are highlighted by discussing the identification, production and characterization of potential new drug targets in this study. The successful development of new and specific pharmaceuticals requires that the target for the respective new drug is available as a pure and homogenous molecule in its native state. Typically, the target molecule is a protein. E.g. antibacterial drugs target proteins from a bacterial pathogen or in human diseases pharmaceuticals predominantly target proteins of signaling pathways or receptors. These proteins are usually not available directly from the organism itself and have to be produced in an expression host and purified to homogeneity. Despite the advances in the field of recombinant protein expression and purification many proteins are very difficult to produce and thus represent the major bottleneck in the development of new pharmaceuticals. In particular demanding is the expression of metalloproteins, which make up to 30% of all proteins coded in the human genome and represent a major challenge in recombinant protein production. Metalloproteins are a diverse class of proteins that is crucial for various biological processes. They play an important role in the regulation, catalysis, and maintenance of biomolecular structure. Alone, 10% of all human proteins contain zinc ions and 2% contain iron, and both metal ions are often inserted by specific but so far unknown chaperones impeding the recombinant production of correctly folded and active proteins. The challenges in studying these metalloproteins arise from their complex structures and the difficulty of their expression and isolation. To overcome these problems new approaches and solutions are highlighted and exemplified by the production and characterization of potential new drug targets in this study. The focus lies particularly on metalloproteins that play a role in infectious diseases. Global health challenges include the persistent threat of infectious diseases despite advances in healthcare, hygiene and therapeutics. The COVID-19 pandemic and rising antibiotic resistance are prime examples of the ongoing risks. This research focuses on three different proteins: (1) the maturation factor NqrM from the bacterial pathogen Vibrio cholerae, (2) the human regulator of the interferon response ubiquitin-specific protease 18 (USP18) and its interaction partners, as well as (3) the viral Papain-like protease (PLpro) from the pathogenic virus SARS-CoV-2. All three proteins belong to the class of metalloproteins and bind either iron as in the case of NqrM or zinc as for USP18 and PLpro. New methods and strategies were developed to produce, isolate and investigate these metalloproteins and since all three proteins represent potential drug targets the results presented here provide the basis for future drug development. The production of proteins requires the selection of appropriate expression host systems such as bacteria, yeast, mammalian cells, etc., depending on the desired application. The study emphasizes the versatility of expression host E. coli due to its well-studied genetics, rapid growth kinetics and ease of handling. However, challenges such as the lack of post-translational modifications can lead to the production of non-functional proteins. Optimization of expression strategies is crucial, and the study describes various factors affecting protein production, including protein engineering, growth conditions, media composition and induction parameters expanding and enhancing the well-established E.coli expression system also for very challenging target proteins. The successful isolation of the proteins formed the fundamental basis for a detailed functional and structural characterization of the proteins. The research presented here takes a forward approach and encompasses the new strategies in cloning, recombinant expression and purification of proteins from bacteria, viruses and humans, emphasizing the advantages and disadvantages of homo- and heterologous recombinant expression. The results obtained highlight also the need for extensive experimental testing to establish optimal conditions, particularly for challenging proteins such as the metalloproteins studied here.
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    Publication
    TRPL-Recycling in Photorezeptoren von Drosophila : Identifikation beteiligter Gene mittels tsCRISPR Mutagenesescreen
    (2025) Zeger, Matthias; Huber, Armin
    Die präzise Regulation des intrazellulären Transports von Membranproteinen ist essenziell für die Funktion neuronaler Zellen. Störungen in diesem Prozess, insbesondere im Proteinrecycling über den Retromerkomplex, stehen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson. In dieser Arbeit wurde die lichtabhängige Translokation des TRPL (Transient Receptor Potential Like)-Ionenkanals im Drosophila-Komplexauge als Modell genutzt, um molekulare Komponenten des Membranproteintransports zu identifizieren. Bei Dunkelheit ist TRPL in den Rhabdomeren lokalisiert und transloziert nach Belichtung, aus dem Rhabdomer ins Zellinnere. Bei anhaltender Belichtung wandert der Großteil des TRPLs innerhalb von 12 Stunden zu einem Speicherkompartiment, das bislang als das Endoplasmatische Retikulum identifiziert wurde. Bei ausbleibendem Lichtreiz bzw. bei einer erneuten Dunkeladaptation der Photorezeptorzellen von Drosophila wandert TRPL innerhalb von 90–120 min wieder zurück in die rhabdomerische Membran. Ein augenspezifisches CRISPR-Knockout-System für Drosophila wurde etabliert, um gezielt Rab-GTPasen – zentrale Regulatoren des intrazellulären Vesikeltransports – im Zusammenhang mit dem TRPL-Recycling zu untersuchen. Durch die Analyse der TRPL-Lokalisation unter verschiedenen Lichtbedingungen konnten mehrere Rab- Proteine mit potenzieller Funktion im Recyclingprozess identifiziert und immunhistochemisch charakterisiert werden. Besonders starke Effekte auf das TRPLRecycling zeigten die Rab3-, Rab4-, Rab7-, Rab32-, Rab40- und RabX2-Knock-out Mutanten. Rab3, das unter anderem an späten Endosomen lokalisiert ist, wurde erstmals in vivo als Regulator für das Proteinrecycling identifiziert. RabX2 hingegen ist am trans-Golgi lokalisiert; sein Knock-out führte zu einer Akkumulation von TRPL im trans-Golgi während des retrograden Transports zurück in das Rhabdomer. Die Ergebnisse legen nahe, dass TRPL auch über einen zweiten ER-unabhängigen Weg zurück in das Rhabdomer recycelt wird, da ein Knock-Out von Rab3, Rab7, Rab32 oder Rab40 die ER/TRPL-Kolokalisation stark verringert aber der Rücktransport weniger stark beeinflusst wird. Außerdem wurde eine weitere TRPL-Recyclingroute über den trans-Golgi identifiziert welche abhängig von RabX2 ist. VII Im zweiten Teil der Arbeit wurde mittels TurboID-basiertem Biotin-Proximity Labeling nach TRPL-assoziierten Interaktionspartnern gesucht. Eine Auswahl der dabei identifizierten Kandidaten wurde funktionell analysiert, um ihren Einfluss auf die TRPLTranslokation zu bewerten. In dem Screen nach TRPL Interaktionspartnern wurden Signaltransduktionsproteine wie INAD, TRP und NorpA durch TRPL::TbID identifiziert. Darüber hinaus wurden Proteine wie Rab32 und Vps35 detektiert, die mit dem TRPLRecycling in Verbindung stehen, sowie weitere Proteine wie Sec61 und HIP-R, die potenziell mit ER-Stress assoziiert sind. Zu den weiteren identifizierten TRPLInteraktionspartnern gehörten Vap33, PIP82, Orp8, Sec63 und Sec22, die detailliert immunhistochemisch untersucht wurden. Dabei zeigte der Knock-out von Sec22 und Sec63 eine reduzierte Kolokalisation von TRPL mit Calnexin (Cnx), jedoch blieb der Rücktransport weitgehend wildtypisch – ein Phänotyp, der dem von Rab3-, Rab7-, Rab32- und Rab40-Knock-outs ähnelt. Die Orp8 Knock-out-Mutante zeigte nach erneuter Dunkeladaptation weiterhin eine TRPL/Cnx-Kolokalisation, was auf einen Defekt beim ER-Exit hinweist. Die PIP82-Nullmutante verursachte einen Internalisierungsdefekt sowie eine deutliche Abnahme des TRPL-Signals nach Lichtadaptation. Der Vap33 Knock-out führte bereits im Dunkelzustand zu anterograden Transportdefekt, da TRPL teilweise im Zytosol und ER lokalisiert war. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass neben dem ERabhängigen Recyclingweg von TRPL auch ein ER-unabhängiger Transportmechanismus existiert. Beide Routen sind auf die Funktion verschiedener Rab-GTPasen angewiesen. Besonders hervorzuheben ist der Nachweis einer Beteiligung von Rab3 am Proteinrecycling in Drosophila-Photorezeptorzellen – ein bisher nicht beschriebenes Phänomen, das über die bekannte Rolle von Rab3 in der synaptischen Transmission hinausgeht. Darüber hinaus wurde erstmals ein TRPLRecyclingweg über den trans-Golgi-Apparat identifiziert, der auf die Aktivität von RabX2 angewiesen ist. Ergänzend dazu konnten mehrere potenzielle Interaktionspartner von TRPL durch Biotin-Proximity Labelling identifiziert werden, darunter Vap33, PIP82, Orp8, Sec63 und Sec22. Funktionelle Analysen deuten darauf hin, dass diese Proteine einen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation und Translokation von TRPL haben und somit eine Rolle in seiner dynamischen Regulation spielen könnten.