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Analyse viraler Promotoren von Phycodnaviren und deren Interaktion mit Transkriptionsfaktoren
(2025) Wahl, Benjamin; Pfitzner, Artur
Acanthocystis turfacea Chlorella Virus 1 (ATCV-1) ist ein dsDNA-Virus aus der Gattung Chloroviren, welches Chlorella heliozoae infiziert. Das Virus besitzt 860 offene Leserahmen (open reading frames, ORF), die für die Gene codieren, die für einen korrekten Virusreplikationszyklus benötigt werden. Diese Gene werden in sehr frühe/frühe/späte Gene eingeteilt. Diese Einteilung basiert auf den Zeitpunkten der Expression der Gene. Für die Expression dieser Gene nutzt ATCV-1 virale Promotoren, die eine Mischung aus eukaryotischen und prokaryotischen Bestandteilen darstellen. Die erfolgreiche Initialisierung des Replikationszyklus mit Hilfe von sehr frühen und frühen Genen ist essenziell für eine vollständige Virusreplikation. In früheren Arbeiten konnten Gene in Paramecium busaria Chlorella Virus 1 (PBCV-1) identifiziert werden, die als sehr frühe Gene klassifiziert wurden. Das Ziel dieser Arbeit beinhaltet die Untersuchung sehr früher/ früher Gene und deren Promotoren. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Interaktion von Proteinen, deren Promotor ein Hex-Motiv (XXXCGTGG) enthalten, mit verschiedenen Faktoren untersucht werden. Basierend auf Sequenzvergleich-Analysen zwischen den sehr frühen Genen aus PBCV-1 und den Genen aus ATCV-1 wurden 20 Gene identifiziert. Die Promotoren dieser Gene wurden auf ihre Motive analysiert. Mit Hilfe einer RT-qPCR konnte gezeigt werden, dass diese Gene in der sehr frühen Phase der Virusreplikation (5 min p.i.) alle aktiv waren. Die Analyse in Pflanzen konnte zeigen, dass das Hex-Motiv in Verbindung mit mindestens einer TATA-Box ideal für die Expression der frühen Promotoren ist. Weitere Analysen konnten zeigen, dass für eine generelle Expression in Pflanzen mindestens zwei TATA-Box-Motiv in Verbindung mit anderen Motiven existieren müssen. In HEK293-Zellen konnte für die Promotoren mit dem Hex-Motiv ebenfalls eine Aktivität demonstriert werden. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Arg7-ASL-System zur Untersuchung der Aktivität von viralen Promotoren genutzt werden konnte. Alle frühen Promotoren zeigten eine Aktivität in Chlamydomonas reinhardtii, inklusive Promotoren anderer Viren. Promotoren mit dem Hex-Motiv zeigten, im Vergleich zu Promotoren ohne dieses Motiv, eine Interaktion mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, die zu den bZIP-Transkriptionsfaktoren gezählt werden. Mit Hilfe zweier Proteine, Z174L und Z765R, deren Promotoren das Hex-Motiv besitzen, konnten mehrere mögliche Interaktionspartner mit Hilfe von „proximity based labeling“, darunter Proteine wie z.B. Actin, Thioredoxin und ein Histon-Acetlytransferase-Protein, identifiziert werden. Diese Proteine können mit der Transkription in Verbindung gebracht werden, was die vermutete Funktion von Z765R als Transkriptionsfaktor stützt. Z174L ist vermutlich ein Transkriptionsfaktor bzw. eine Endonuklease. Auch hierfür konnten Proteine, die diese Hypothese unterstützen, mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert werden. In dem dritten Teil der Arbeit konnte mit Hilfe von Yeast-1-Hybrid-Analysen und dem Promotor von Z063L ein neues Protein, Activating protein 63 (Ap63), in Chlamydomonas reinhardtii identifiziert werden. Dieses Protein besitzt Motive, die mit DNA-Bindung in Verbindung gebracht werden. Kombiniert mit Analysen der Sequenz, handelt es sich bei dem hier entdeckten Protein vermutlich um einen Transkriptionsfaktor. Das Gesamtbild dieser Studie zeigt auf, wie abhängig das Virus von seinem Wirt für eine erfolgreiche Replikation ist und wie breit das Spektrum der Virus-Wirt-Interaktion ist. Die sehr frühe Genexpression (5 min p.i.) spielt eine essenzielle Rolle für die Replikation. Hierfür macht sich das Virus Proteine (vor allem Transkriptionsfaktoren) des Wirts zunutze, um die gesamte Genexpression der Wirtszelle auf die Virusreplikation umzuprogrammieren.
Bioeffector products for plant growth promotion in agriculture
modes of action and the application in the field
(2021) Weber, Nino Frederik; Neumann, Günter
Modern agriculture faces a conflict between sustainability and the demand for a higher food production. This conflict is exacerbated by climate change and its influence on vegetation, ecology and human society. To reduce land use, the reduction of yield losses and food waste is crucial. Moreover a sustainable intensification is necessary to increase yields, while at the same time input of limited resources such as drinking water or fertilizer should be kept as low as possible. This might be achieved by improving nutrient recycling and plant resistance to abiotic or biotic stress. Bioeffectors (BE) comprise seaweed or plant extracts and microbial inoculums that may stimulate plant growth by phytohormonal changes and increase plant tolerance to abiotic stress (biostimulants), solubilize or mobilize phosphorus from sparingly soluble sources such as Al/Fe or Ca-phosphates in the soil, rock phosphates, recycling fertilizer or organic phosphorus sources like phytate (biofertilizer), or improve plant resistance against pathogens by induced-systemic resistance (ISR) or antibiosis (biocontrol). For this study, in total 18 BE products were tested in germination, pot and field experiments for their potential to improve plant growth, cold stress tolerance, nutrient acquisition and yield in maize and tomato. Additionally, a gene expression analysis in maize was performed using whole transcriptome sequencing (RNA-Seq) after the application of two potential plant growth promoting rhizobacteria (PGPR), the Pseudomonas sp. strain DSMZ 13134 “Proradix” and the Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42. Seaweed products supplemented with high amounts of the micronutrients Zn and Mn were effective in reducing detrimental cold stress reactions in maize whereas microbial products and seaweed extracts without micronutrient supplementation failed under the experimental conditions. At optimal temperature the product containing the Pseudomonas sp. strain was repeatedly able to stimulate root and shoot growth of maize plants whereas in tomato only in heat-treated soil substrate significant effects were observed. Results indicate that the efficacy of the product was mainly attributed to stimulation or shifts in the soil microbial community. Additionally, the FZB42 strain was able to stimulate root and plant growth in some experiments whereas the effects were less reproducible and more sensitive to environmental conditions. Fungal BE products were less effective in plant growth stimulation and showed detrimental effects in some experiments. Under the applied experimental conditions BE-derived plant growth stimulation mainly was attributed to biostimulation but aspects of biofertilization or biocontrol cannot be excluded, as all experiments were conducted in non-sterile soil substrates. Root and shoot growth are stimulated in response to hormonal shifts. In the gene expression analysis only weak responses to BE treatments were observed, as previously reported from other studies conducted under non-sterile conditions. Nevertheless, some plant stress responses were observed that resembled in some aspects those reported for phosphorus (P) deficiency in others those reported for ISR/SAR. Especially the activation of plant defence mechanisms, such as the production of secondary metabolites, ethylene production and reception and the expression of several classes of stress-related transcription factors, including JA-responsive JAZ genes, was observed. It also seems probable that in plants growing in PGPR-drenched soils, especially at high application rates, a sink stimulation for assimilates triggers changes in photosynthetic activity and root growth leading to an improved nutrient acquisition. Nevertheless, due to the complexity of interactions in natural soil environments as well as under practice conditions, a designation of a distinct mode of action for plant growth stimulation by microbial BEs is not realistic. A comparison of the overall results with those reported in literature or other working groups in a common research project (“Biofector”) supported the often-reported low reproducibility of plant growth promotion effects by BE products under applied conditions. Factors that influenced BE efficacy were application time and rates, temperature, soil buffer capacity, phosphorus sources and nitrogen fertilization, light conditions and the soil microbial community. Results indicate that in maize cultivation seed treatment is the most economic application technique for microbial products whereas for vegetable or high-value crops with good economic benefit soil drenching is recommended. For seaweed extracts foliar application seems to be the most economic and efficient choice. Furthermore, results emphasize the importance of a balanced natural soil microflora for plant health and yield stability.