Microbiological and proteome analysis to gain insights into the pathogenesis of the highly adapted not-cultivated hemotrophic Mycoplasma suis

Abstract

The aims of this work were to establish a chronic pig infection model and to clarify unrecognized transmission pathways of M. suis. In addition, proteomics-based investigations of M. suis should be performed to improve the knowledge on the host pathogen interactions and host adaptation in IAP. Based on the succeeded and frequently applied splenectomized M. suis pig model (acute infection model) it was possible to establish a novel non-splenectomized M. suis pig model. This infection model enables the experimental investigation of the chronic M. suis infection. To this end, the piglets were infected intramuscularly with a highly virulent M. suis strain. Infected animals exhibited clinical signs (e.g. Morbus maculosus) including the typical cyclic course of chronic IAP. In the next step, potential transmission pathways of M. suis were analyzed during acute and chronic M. suis infection based on these two pig infection models. Feces, urine, air and dust as well as nasal, vaginal and saliva excretions were collected during the course of infection and examined for M. suis DNA by Rt-PCR. For the first time it was possible to detect M. suis in urine with and without erythrocytes as well as in nasal, vaginal and saliva excretions during acute and chronic infections. These results indicate blood-independent M. suis transmission via vaginal discharge, nasal excretions, saliva, and urine. The non-culturability limited the improvement of proteomic-based investigations of M. suis-related host-pathogen interactions. Therefore, we used modern and sophisticated proteome analysis to solve this problem. Blood samples from experimentally infected pigs at different time points of infection were investigated. For this, novel enrichment methods for M. suis proteins (especially membrane proteins) were established. These methods enabled an improved resolution of the protein expression profile of M. suis and thereby deeper insights into the pathogenesis of this microorganism. Despite of the missing cultivation system it was possible to identify more than 50% of the predicted M. suis proteins during acute infection. This identification ratio is similar to the one found in cultivable bacteria. Furthermore, the results of the proteome analysis indicate that nutrients such as glucose, hexose-6-phosphate, spermidine, putrescine, phosphate, amino acids, magnesium, potassium, sodium and iron are taken up by M. suis from the host leading to the high degree of host adaptation. Therefore, gained information on expressed M. suis proteins involved in transport are helpful in the establishment of an in vitro cultivation system in future. Particularly the supplementation of individual nutrients can play key functions in the media to support growth. Besides the M. suis proteome the acquired dataset firstly enables also the quantitative identification of Sus scrofa proteins differentially expressed during M. suis infection. This information can be used to unravel infection-relevant processes in the host in further studies.

Ziele dieser Arbeit waren, ein Infektionsmodel im Schwein zu etablieren, dass den chronischen Verlauf der IAP darstellt, bisher unerkannte potenzielle Übertragungswege zu identifizieren und abschließend anhand Proteom-basierter Untersuchungen M. suis-spezifische Wirts-Pathogen Interaktionen sowie die Wirtsabhängigkeit genauer zu untersuchen. Als Ergänzung zu dem bereits sehr häufig erfolgreich verwendeten Schweinemodel (mit Splenektomie), dass die akute Verlaufsform einer natürlichen IAP widerspiegelt, gelang es uns ein neues Schweinemodel zu etablieren, dass die detaillierte Untersuchung von chronisch verlaufenden, phasenweise klinisch inapparenten M. suis-Infektionen erlaubt. Hierfür werden Ferkel ohne vorhergehende Splenektomie intramuskulär mit einem hoch-virulenten M. suis Stamm infiziert. Bei den experimentell infizierten Ferkeln konnte neben Symptomen einer chronischen IAP (z.B. Morbus maculosus) auch der typische zyklische Verlauf der chronischen M. suis-Infektion beobachtet werden. Unter Verwendung der beiden beschriebenen Infektionsmodelle wurden potenzielle Übertagungswege von M. suis während der akuten bzw. der chronischen Verlaufsform der IAP untersucht. Dazu wurde von den experimentell infizierten Schweinen Kot, Harn, Nasen-, Vaginal- und Speichelsekret sowie Proben aus der Umgebung der Tiere (Wasser, Luft und Staub) gesammelt und mittels Rt-PCR auf die Anwesenheit von M. suis-DNA analysiert. Die Studien zeigten erstmals, dass M. suis offensichtlich sowohl über Harn (mit und ohne Erythrozyten) als auch über Nasen-, Vaginal- und Speichelsekret während der chronischen und der akuten Verlaufsform der Krankheit ausgeschieden wird. Somit ist klar, dass die Übertragung von M. suis Blut unabhängig über Körpersekrete und Harn möglich ist. Die Erforschung der Wirt-Pathogen Interaktionen und der spezifischen Anpassung von M. suis an seinen Wirt ist durch den nicht-kultivierbaren Status des Erregers limitiert. Um diese Probleme zu lösen, wurden moderne und hochentwickelte Proteomanalysen durchgeführt. Als Untersuchungsmaterial dienten Blutproben experimentell infizierter Schweine aus unterschiedlichen Infektionsstadien. Anhand dieser Proben gelang es, eine Anreicherungsmethode für M. suis Proteine (insbesondere Membranproteine) zu etablieren. Diese ermöglicht eine verbesserte Auflösung des Proteinexpressionsmusters von M. suis und gewährleistet tiefere Einblicke in dessen Pathogenese. So konnten trotz der Unkultivierbarkeit des Erregers ca. 50% der vorhergesagten M. suis-Proteine während einer akuten Phase der Infektion detektiert werden. Diese Proteinexpressionsdaten von M. suis sind aufgrund ihrer hohen Auflösung erstmals mit Proteomanalysen von kultivierbaren Bakterien vergleichbar. Des Weiteren zeigten die gewonnenen Daten, dass Nährstoffe wie Glukose, Hexose-6-Phosphat, Spermidin, Phosphat, Aminosäuren, Magnesium, Kalium, Natrium und Eisen, während einer M. suis-Infektion aus der Wirtsumgebung von M. suis aufgenommen werden. Die gewonnenen Erkenntnisse über die exprimierten potenziellen M. suis-Transportersysteme spielen insbesondere für die Entwicklung eines in vitro-Kultivierungssystems eine wichtige Rolle, da die Ergänzung eines essentiellen Nährstoffes in einem Wachstumsmedium zur Unterstützung des Wachstums, eine Schlüsselfunktion einnehmen kann. Neben den M. suis-Proteomdaten konnten im Untersuchungsmaterial auch erstmals Daten zu unterschiedlich exprimierten Sus scrofa Proteinen während einer M. suis Infektion quantitativ erfasst werden. Diese Informationen können in weiteren Studien dazu genutzt werden, infektions-relevante Prozesse im Wirt besser zu verstehen.