Analyse des Flow-abhängigen Symmetriebruchs im Frosch Xenopus : die Funktion des Nodal-Inhibitors Coco

Abstract

The bilaterally symmetrical vertebrate body plan is characterized by the three body axes, anterior-posterior (AP), dorsal-ventral (DV) and the left-right (LR). The LR-axis is the last one to be specified during embryonic development. Its impact on the morphology of the developing organism is visible after a few days in Xenopus laevis, because of the orientation of the visceral organs, such as the heart, gut and the gall bladder. The first molecular differences between the left and right side can already be detected after one day during early neurulation. It is found at the gastrocoel-roof-plate (GRP), a ciliated epithelium which is essential for symmetry breakage. Cilia rotate to produce a leftward fluid movement, which represses the Cerberus/DAN gene Coco in the lateral cells of the epithelium. As Coco acts as an inhibitor of the coexpressed TGFß-type growth factor Nodal (Xnr1), Xnr1 is flow-dependently released from repression on the left side. Xnr1 is capable to induce a unilateral gene-cascade in the left lateral plate mesoderm (LPM) consisting of Nodal itself, its antagonist Lefty/ antivin and the homeobox gene Pitx2c. A central question in this setting concerns the mechanism by which flow results in the repression of Coco. The analysis of Coco transcription gave a first hint, indicating that Coco mRNA is post-transcriptionally degraded and/ or that its translation is blocked. Gene regulation at the level of mRNA usually occurs through the untranslated regions (UTR), in most cases via the 3UTR. To examine the role of the Coco 3UTR for its regulation, protector-RNAs were used which should protect endogenous Coco mRNA from potential inhibitors. Injections led to the interruption of the flow-dependent Coco repression, verifying regulation of Coco via the 3UTR. As 3UTRs are target sites for microRNAs, loss of function experiments of the processing enzyme Dicer were performed. These experiments verified the involvement of miRNAs in the regulation of Coco. Further analyses identified miR-15a as a central player. The interruption of its synthesis or the specific protection of its binding site within the Coco 3UTR prevented flow-dependent down-regulation of Coco. Epistatic experiments demonstrated that the LR-axis of embryos with inhibited flow could be rescued by addition of the miR-15a precursor on the left side. In summary this thesis work revealed miRNAs as a primary target of leftward flow, upstream of the Nodal inhibitor Coco.

Der Bauplan der Vertebraten ist durch drei Körperachsen gekennzeichnet, die anterio¬posteriore (AP), dorsoventrale (DV) und links-rechts (LR) Achse. Die LR-Achse ist die letzte Achse, die während der Embryogenese festgelegt wird. Ihre Ausprägung wird beim Krallenfrosch Xenopus laevis nach einigen Tagen morphologisch anhand der Lage der visceralen Organe wie Herz, Darm und Gallenblase sichtbar. Die ersten molekularen Unterschiede zwischen der linken und rechten Körperhälfte können dagegen schon nach einem Tag, während der frühen Neurulation, detektiert werden. Diese finden sich in der Archenterondachplatte („gastrocoel roof plate“ – GRP), ein ciliertes Epithel, welches für den Symmetriebruch essentiell ist. Ihre rotierenden Monocilien erzeugen einen linksgerichteten Flüssigkeitsstrom, welcher das Cerberus/ DAN-Gen Coco unterdrückt. Da Coco als Inhibitor des bilateralsymmetrisch ko-exprimierten TGFß-Faktors Nodal (Xnr1) agiert, wird Xnr1 Flüssigkeitsstrom-abhängig aus seiner Reprimierung entlassen. Nun ist Xnr1 in der Lage eine unilaterale Signal¬kaskade im linken Seitenplattenmesoderm (SPM) mit sich selbst, seinem Antagonisten Lefty/ antivin und dem Homeoboxgen Pitx2c zu induzieren. Eine zentrale Frage dieses Szenarios ist die nach dem Mechanismus, durch welchen der Flüssigkeitsstrom die Repression von Coco erzielt. Die Analyse der Coco- Transkription gab den ersten Hinweis, dass Coco mRNA posttranskriptionell abgebaut und/ oder seine Translation unterbunden wird. Die Genregulation auf Ebene der mRNA erfolgt für gewöhnlich durch ihre untranslatierten Regionen (UTR), meist durch die 3-UTR. Um die Rolle der Coco 3-UTR für seine Regulation zu untersuchen, wurden Protektor-RNAs verwendet, welche endogene Coco mRNA vor ihren Inhibitoren schützen sollte. Ihre Injektion führte zur Unterbindung der Flüssigkeitsstrom-abhängigen Coco-Repression und bestätigte so die Regulation von Coco über seine 3-UTR. Da 3-UTRs der Angriffspunkt von mikroRNAs sind, wurden Funktions-verlustversuche des Syntheseenzyms Dicer durchgeführt. Diese Versuche bestätigten ihre Beteiligung innerhalb der Coco-Regulation. Anschließende Untersuchungen identifizierten miR-15a als zentralen Spieler. Wurde ihre Synthese verhindert oder ihre Bindestelle innerhalb der Coco 3-UTR spezifisch geschützt, konnte die Strom-abhängige Coco-Repression unterbunden werden. Epistasisexperimente demonstrierten, dass die LR-Achse von Embryonen mit inhibierter Flüssigkeitsströmung durch die Zugabe eines miR-15a Vorläufermoleküls auf der linken Seite wieder hergestellt werden konnte. Zusammenfassend enthüllte diese Arbeit, dass miRNAs dem Nodal-Inhibitor Coco vorgeschaltet und somit das primäre Ziel des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms sind.