Characterization of host and bacterial proteins in crossbred grower pigs at marginal lysine concentration

Abstract

The current pork production strategies still result in high nitrogen emissions and thus harmful effects on the environment. The animals excrete about two-thirds of the protein in the diet unused, which increases nitrogen emissions and makes feeding the animals according to their needs expensive and inefficient. To minimize the negative aspects of pork production, it is important to reduce the use of proteins in feed while improving the protein efficiency of pigs. Improving protein efficiency requires a comprehensive understanding of physiological processes, particularly enzymatic activities, amino acid transporter capacities, the proteome, the metabolome and the microbiome. The aim of this work was therefore to identify animal- specific and quantitatively expressed proteins, enzymes, amino acid transporters and metabolites and to correlate these findings with protein turnover data. The study also examined whether the efficiency of protein utilization is influenced by these variables. A total of 48 male crossbred animals (German Landrace x Pietrain) were slaughtered in the 21st week of life for the present experiment. The animals were kept individually under the same conditions from the 75th day of life until the day of slaughter. A two-phase ad libitum feeding was carried out, with the change from phase 1 to phase 2 taking place in the 14th week of life. Since the genetic potential of protein utilization efficiency was to be estimated, the content of the first limiting amino acid lysine was 90 %, just below the GfE (2006) requirement limit in order to ensure a limiting factor for the protein approach. Thus, lysine was the limiting factor for protein retention and allowed animals to exploit their full genetic potential for protein utilization. After euthanizing, the animals were opened, and the stomach, small intestine and large intestine removed. Mucosal samples were taken from the sections of the pars nonglandularis, cardiac gland zone and pars pylorica, as well as digesta samples from the stomach. In addition, digesta and mucosal samples were collected from the duodenum, jejunum, ileum, colon, and cecum. The proteome in all samples was analyzed. The metabolome and enzyme activities were determined in all digesta samples. In addition, amino acid transporter expression was examined in all small intestinal mucosal samples. The activity of the enzymes trypsin, chymotrypsin, carboxypeptidase A and carboxypeptidase B were examined in the digesta samples from all sections. The highest activities were found in the small intestine, the lowest activities in the stomach and large intestine. The trypsin and chymotrypsin activity was highest in the jejunum, whereas the activities of the carboxypeptidases were highest in the duodenum. In addition, individual animal differences in enzyme activities could be identified. In addition, the expression rate of various amino acid transporters was examined in the present work. In the duodenum the transporter SLC1A5 showed the highest expression rate, in the jejunum the transporters SLC5A1 and SLC6A19. In the ileum, the rates of the transporters SLC1A1, SLC7A1 and SLC7A9 were at the highest level. The identification of the host proteome revealed different protein patterns in the examined sections of the gastrointestinal tract. In particular, host proteins were identified in the mucosa samples, with the exception of those from the ileum and cecum. The high number of host proteins in the mucosa samples, which are associated with cellular processes and metabolism, underlines its role in physiological digestive processes. In addition, the examined host proteins could be assigned to numerous KEGG pathways, thus creating a deeper understanding of physiological and metabolic pathways. The study of the bacterial proteome allowed not only categorization into different metabolic pathways, but also identification of the active microbiome in the different sections. For example, it was shown that Firmicutes dominate in the stomach and small intestine, whereas Bacteroidetes are mainly found in the large intestine. This highlights the different roles of the sections examined, with Firmicutes being primarily responsible for breaking down proteins and carbohydrates and Bacteroidetes playing a central role in the fermentation of undigested proteins and carbohydrates in the large intestine. Additionally, the increased presence of Tenericutes in the mucosal samples indicated a possible specialization of this family to the conditions in the mucosal environment, where they interact with host cells and contribute to metabolic processes. The identification of numerous unclassified bacterial groups also shows how complex the composition of the microbiome is and that further research must be carried out in order to be able to fully identify connections. The examination of the various metabolites in the digesta samples from the gastrointestinal tract showed clear differences in the detection rate. While the fatty acids acetate, butyrate, valerate, isobutyrate and propionate were found primarily in the sections of the large intestine, lactate, isovalerate and the amino acids showed a higher occurrence in the sections of the small intestine. This is in line with the scientific knowledge that fatty acids are primarily formed during microbial fermentation in the large intestine and should therefore occur in higher quantities here. Overall, the results of the present work showed that, in addition to physiological differences between the sections of the gastrointestinal tract, there also appear to be significant animal- specific differences in all parameters examined. These differences can have an influence on the efficiency of the animals, but it is still important to find out which factors cause these differences. Since the feeding, husbandry concept and experimental design were chosen in such a way that there is as little variation and discrepancy between the animals as possible, a genetic influence on the efficiency of the animals cannot be ruled out. If the animals' genetic potential to use nitrogen efficiently becomes apparent, a further foundation stone has been laid for making pork production tailored to needs and conserving resources and the environment.

Mit den derzeit eingesetzten Strategien der Schweinefleischproduktion kommt es immer noch zu hohen Stickstoffemissionen und damit auch zu schädlichen Auswirkungen auf die Umwelt. Die Tiere scheiden etwa zwei Drittel des in der Diät enthaltenen Proteins ungenutzt aus, was die Stickstoffemissionen erhöht und die bedarfsgerechte Fütterung der Tiere teuer und ineffizient macht. Um die negativen Aspekte der Schweinefleischproduktion zu minimieren, ist es wichtig, den Einsatz von Proteinen im Futtermittel zu reduzieren und gleichzeitig die Proteineffizienz der Schweine zu verbessern. Die Proteineffizienz zu verbessern erfordert ein umfangreiches Verständnis der physiologischen Abläufe, insbesondere der enzymatischen Aktivitäten, der Kapazitäten von Aminosäuretransportern, des Proteoms, des Metaboloms und des Mikrobioms. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, tierspezifische und quantitativ exprimierte Proteine, Enzyme, Aminosäuretransporter und Metaboliten zu identifizieren und diese Erkenntnisse mit Daten zum Proteinumsatz zu korrelieren. Die Studie untersuchte außerdem, ob die Effizienz der Proteinverwertung durch diese Variablen beeinflusst wird. Insgesamt wurden für den vorliegenden Versuch 48 männliche Kreuzungstiere (Deutsche Landrasse x Pietrain) in der 21. Lebenswoche geschlachtet. Die Tiere wurden ab dem 75. Lebenstag bis zum Tag der Schlachtung in Einzelhaltung unter gleichen Bedingungen gehalten. Es wurde eine zweiphasige ad libitum Fütterung durchgeführt, wobei der Wechsel von Phase 1 auf Phase 2 in der 14. Lebenswoche stattfand. Da das genetische Potenzial der Proteinverwertungseffizienz abgeschätzt werden sollte, lag der Gehalt der ersten limitierenden Aminosäure Lysin mit 90 % knapp unter der Anforderungsgrenze der GfE (2006), um einen limitierenden Faktor für den Proteinansatz sicherzustellen. Somit war Lysin der limitierende Faktor für die Proteinretention und ermöglichte es den Tieren, ihr volles genetisches Potenzial zur Proteinverwertung auszuschöpfen. Nach dem Einschläfern wurden die Tiere geöffnet und Magen, Dünndarm und Dickdarm entnommen. Es wurden Schleimhautproben aus den Abschnitten der Pars nonglandularis, Herzdrüsenzone und Pars pylorica sowie Digestaproben aus dem Magen entnommen. Außerdem wurden Digesta- und Schleimhautproben aus dem Duodenum, Jejunum, Ileum, Colon und dem Ceacum entnommen. Anschließend wurde das Proteom in allen Proben analysiert. In allen Digestaproben wurde das Metabolom sowie die Enzymaktivitäten bestimmt. Darüber hinaus wurde die Aminosäuretransporter-Expression in allen Schleimhautproben des Dünndarms untersucht. Die Aktivität der Enzyme Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase A und Carboxypeptidase B wurden in den Digesta Proben aller Abschnitte untersucht. Die höchsten Aktivitäten wurden im Dünndarm festgestellt, die niedrigsten Aktivitäten im Magen und Dickdarm. Die Trypsin- und Chymotrypsinaktivität war hierbei im Jejunum am höchsten, wohingegen die Aktivitäten der Carboxypeptidasen im Duodenum am höchsten waren. Zusätzlich konnten tierindividuelle Unterschiede der Enzymaktivitäten identifiziert werden. Außerdem wurde in der vorliegenden Arbeit die Expressionsrate verschiedener Aminosäuretransporter untersucht. Im Duodenum zeigte der Transporter SLC1A5 die höchste Expressionsrate, im Jejunum die Transporter SLC5A1 und SLC6A19. Im Ileum lagen die Raten der Transporter SLC1A1, SLC7A1 und SLC7A9 auf dem höchsten Niveau. Die Identifizierung des Wirtsproteoms zeigte verschiedene Proteinmuster in den untersuchten Abschnitten des Magen-Darm-Trakts. So konnten in den Mucosaproben, mit Ausnahme derer des Ileums und Caecums, vor allem Wirtsproteine identifiziert werden. Die hohe Anzahl an Wirtsproteinen in den Proben der Mucosa, welche assoziiert sind mit zellulären Prozessen und dem Metabolismus, unterstreicht dessen Rolle bei physiologischen Verdauungsprozesse. Außerdem konnten die untersuchten Wirtsproteine zahlreichen KEGG Stoffwechselwegen zugeordnet werden und so ein tieferes Verständnis für physiologische und metabolische Stoffwechselwege geschaffen werden. Die Untersuchung des bakteriellen Proteoms erlaubte nicht nur eine Kategorisierung in verschiedene metabolische Stoffwechselwege, sondern auch eine Identifizierung des aktiven Mikrobioms in den verschiedenen Abschnitten. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Firmicutes im Magen und Dünndarm dominieren, wohingegen Bacteroidetes vor allem im Dickdarm zu finden sind. Dies unterstreicht die verschiedenen Aufgaben der untersuchten Abschnitte, wobei Firmicutes vor allem für den Abbau von Proteinen und Kohlenhydraten verantwortlich sind und Bacteroidetes eine zentrale Rolle bei der Fermentation unverdauter Proteine und Kohlenhydrate im Dickdarm spielen. Zusätzlich zeigte das vermehrte Vorkommen von Tenericutes in den Mucosaproben eine mögliche Spezialisierung dieser Familie auf die Bedingungen im mucosalen Umfeld, wo sie mit Wirtszellen interagieren und zu metabolischen Prozessen beitragen. Die Identifizierung zahlreicher unklassifizierter Bakteriengruppen zeigt außerdem, wie Komplex die Zusammensetzung des Mikrobioms ist und das weitere Forschungsarbeit aufgewendet werden muss um Zusammenhänge vollständig identifizieren zu können. Die Untersuchung der verschiedenen Metabolite in den Digesta Proben des Magen-Darm-Trakts zeigte deutliche Unterschiede in der Auffindungsrate. Während die Fettsäuren Essigsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Isobuttersäure, Propansäure vor allem in den Abschnitten des Dickdarms gefunden wurden, zeigten Milchsäure, Isovaleriansäure und die Aminosäuren ein höheres Vorkommen in den Abschnitten des Dünndarms. Die steht in Einklang mit der wissenschaftlichen Erkenntnis, dass Fettsäuren vor allem bei der mikrobiellen Fermentation im Dickdarm gebildet werden und somit hier in höherem Maße auftreten sollten. Insgesamt zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass es neben physiologisch bedingten Unterschieden zwischen den Abschnitten des Magen-Darm-Trakts, auch erheblich tierspezifische Unterschiede bei allen untersuchten Parametern zu geben scheint. Diese Unterschiede können einen Einfluss auf die Effizienz der Tiere haben, jedoch gilt es Weiterhin herauszufinden, durch welche Faktoren diese Unterschiede bedingt werden. Da Fütterung, Haltungskonzept und das Versuchsdesign so gewählt wurden, dass es möglichst zu wenig Variation und Diskrepanz zwischen den Tieren kommt, ist ein genetischer Einfluss auf die Effizienz der Tiere nicht auszuschließen. Sollte sich ein genetisches Potential der Tiere Stickstoff effizient zu nutzen zeigen, ist ein weiterer Grundstein gelegt, die Schweinefleischproduktion bedarfsgerecht, ressourcen- und umweltschonend zu gestalten.