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Doctoral Thesis
2021
Characterization of function and regulation of the subtilase cytotoxin and Shiga toxin of pathogenic Escherichia coli
Characterization of function and regulation of the subtilase cytotoxin and Shiga toxin of pathogenic Escherichia coli
Abstract (English)
Food-borne diseases caused by enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) constitute a great threat to human health worldwide. Pathogenicity of EHEC strongly depends on the ability to produce virulence factors such as amongst others bacterial toxins. One of these toxins are the so-called Shiga toxins (Stx), which is why EHEC are assigned to the group of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). Stx belong to the family of AB5 protein toxins consisting of two subunits. One of them, the StxA-subunit causes depurination of the 28S rRNA in eukaryotic ribosomes by exhibiting N-glycosidase activity subsequently leading to inhibition of the protein biosynthesis followed by apoptosis of the host cell. The second one is the homopentameric B-subunit, which mediates binding to the host cell surface via the receptor glycolipid globotriaosylceramide (Gb3). Besides Stx, the subtilase cytotoxin (SubAB) has been described in STEC in recent years. SubAB, also assigned to the family of AB5 toxins, generates its cytotoxic activity via cleavage of the endoplasmic chaperone binding immunoglobulin protein (BiP) by its A-subunit. This cleavage leads to an unfolded protein response, resulting in apoptosis of the host cell. The B-subunit forms a ring-like homopentameric structure which is responsible for the binding to the receptor N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) and other O-glycans. Although the mode of cytotoxicity of AB5 toxins have been studied extensively, some mechanisms remain unsolved. The scope of this thesis was to analyze further the mode of action of AB5 toxins and the gene regulation of stx and subAB. Both publications included in this thesis combine the characterization of the cytotoxic activity of AB5 toxins, the regulation of their genes, their subunits, and the combination of subunits of Stx and SubAB. In the first publication the regulation of gene expression of AB5 toxins was investigated in more detail. In this study, the gene expression of subAB1 was analyzed with a luciferase reporter gene assay and by quantitative real-time polymerase chain reaction. To unravel the regulatory mechanisms, both the laboratory E. coli strain DH5α and the STEC O113:H21 strain TS18/08 were used. Expression of subAB1 and promoter activity was studied using standard cultivation methods. Moreover, this work shed light on the impact of the global regulatory proteins host factor of bacteriophage Qβ (Hfq) and histone-like nucleoid structuring protein (H-NS) on subAB1 gene expression. Therefore, isogenic deletion mutants of hfq and hns gene were generated in the respective strains. Afterwards, plasmid-based complementation was conducted to verify that the observed effects were due to the deletion. Analysis of subAB1 promoter activity revealed impact of both Hfq and H-NS during different growth phases in both strains. In addition, the influence of both regulatory proteins on the expression toxin genes in STEC strain TS18/08 was investigated. This study did not only focus on the expression of stx2a and subAB1, but also the gene expression of the gene of the cytolethal distending toxin V (cdtV) was analyzed. Interestingly, all three toxin genes studied were upregulated in the deletion mutants of Δhfq and Δhns. Those results demonstrate the impact of global regulatory proteins on AB5 toxin gene expression and show that all three toxin genes investigated are integrated into the same regulatory network. In the second publication, the mode of action of AB5 toxins on the example of Stx2a was analyzed in more detail. The paradigm of AB5 toxin was known as the receptor binding B-subunit which mediates uptake of the enzymatic A-subunit and the subsequent cytotoxic activity. Previous studies have questioned this paradigm by showing cytotoxic effects of the SubA-subunit in absence of its corresponding B-subunit. This work analyzed whether this cytotoxic effect of the A-subunit is not only true for SubAB, but also for Stx. Thus, seperate recombinant expression of StxA2a subunits and subsequent His tag-based purification was performed. Both StxA2a-His and StxB2a-His were analyzed on cytotoxicity separately or in combination with the other subunit. Strikingly, cytotoxic effects of the StxA2a-His was observed in the absence of its corresponding B-subunit cell-type independently on HeLa, Vero B4, and HCT-116 cells. Studies on the B-subunit revealed no cytotoxicity on all cell lines. Additionally, combinations of different A- and B-subunits of Stx2a and SubAB1 proteins were analyzed. The hybrid combination showed that the cytotoxic effect of StxA2a-His on HeLa and HCT-116 cells could be reduced in the presence of the SubB1-His. Contrary, the cytotoxic effects of SubA1- His were unaltered in combination with StxB2a-His. Those results give the assumption that the Stx2aA-subunit binds to a target cell receptor blocked by SubB1-His. Additional experiments on the binding capacity of the Stx2a-subunits to Gb3 revealed that while StxB2a-His was able to bind to the receptor, no binding of the recombinant A-subunit was observed. The results indicate a cytotoxic effect of StxA2a on different cell types in absence of its corresponding B-subunit, which is designated as “single-A” effect in this work. The role of this effect in STEC pathogenicity, the uptake mechanism and subsequent transport inside the host cells of StxA-subunit need to be further analyzed in the future.
Abstract (German)
Durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) verursachten Lebensmittel-assoziierte Krankheiten stellen weltweit ein ernstes Problem dar. Dabei wird die Pathogenität der EHEC vor allem durch die Fähigkeit der Produktion von Virulenzfaktoren, wie z.B. Toxinen, definiert. Eines dieser Toxine ist das sogenannte Shiga Toxin (Stx), weshalb die EHEC zur Gruppe der Shiga Toxin-produzierenden E. coli (STEC) zugeordnet sind. Stx gehören zur Familie der AB5 Toxine und bestehen aus zwei Untereinheiten. Davon hemmt die StxA-Untereinheit die Proteinbiosynthese durch die Depurinierung der 28S rRNA der eukaryotischen Ribosomen, indem sie eine N-Glycosidase Aktivität aufweist und anschließend zur Apoptose der Zielzelle führt. Die zweite Untereinheit ist die homopentamere B-Untereinheit, welche an den Glykolipid-Rezeptor Globotriaosylceramid Gb3 auf der Membran der Zielzelle. In den letzten Jahren wurde in STEC neben dem Stx das Subtilase Zytotoxin (SubAB) beschrieben. Auch SubAB gehört zu der Familie der AB5 Toxine, wobei die A-Untereinheit die zytotoxische Aktivität durch die Spaltung des endoplasmatischen Chaperons Immunoglobulin-Bindeprotein (BiP) aufweist. Diese Spaltung führt zur unfolded protein response (dt. ungefaltete Protein-Antwort) und infolgedessen zum Zelltod. Die B-Untereinheit besteht aus fünf identischen Molekülen, welche ringartig angeordnet sind, und bindet an den Rezeptor N-glykolyneuraminsäure (Neu5Gc) und andere O-Glykane. Obwohl die Mechanismen der Zytotoxizität der AB5 Toxine bereits untersucht wurden, bleiben einige Mechanismen ungeklärt. Dabei stellt das Ziel dieser Dissertation die Charakterisierung der zytotoxischen Aktivität und Regulation der Genexpression von stx und subAB dar. Beide Publikationen im Rahmen dieser Dissertation kombinieren dabei die Charakterisierung der Zytotoxizität dieser AB5 Toxine, der Regulation ihrer Gene, ihrer Untereinheiten und der Kombination der Untereinheiten von SubAB und Stx. In der ersten Publikation wurde die Fragestellung der Regulation der Genexpression von AB5 Toxinen untersucht. Die Genexpression des subAB1 Gens wurde in dieser Studie mit Hilfe der Methoden des Luciferase-Reportergenassays und quantitativer Echtzeit-Polymerase-kettenreaktion (quantitative real time polymerase chain reaction) analysiert. Um die Fragestellung der regulatorischen Mechanismen zu untersuchen, wurden sowohl der Laborstamm E. coli DH5α als auch der STEC O113:H21 Stamm TS18/08 verwendet. Die Expression und Promoteraktivität des subAB1 wurden unter Standard-Kulturbedingungen gemessen. Des Weiteren wurden vor allem der Einfluss der globalen Regulatorproteinen host factor of bacteriophage Qβ (Hfq) und des Histone-ähnlichen Nukleoid bindenden Proteins (H-NS) auf die subAB1 Genexpression untersucht. Dafür wurden isogene Deletionsmutanten der Gene hfq und hns in den beiden genannten Stämmen erstellt. Um zu beweisen, dass die gemessenen Effekte auf diesen Deletionen basieren, wurde anschließend eine Plasmid-basierte Komplementation durchgeführt. Die Analyse der Promoteraktivität zeigte, dass beide Regulatorproteine Hfq und H-NS Einfluss auf diese während unterschiedlichen Wachstumsphasen in beiden untersuchten Stämmen haben. Zusätzlich wurde der Einfluss der beiden Regulatorproteine auf die Genexpression der Toxingene im STEC TS18/08 untersucht. Dabei wurden in dieser Arbeit nicht nur die Gene stx2a, subAB1 untersucht, sondern auch das Gen des Cytolethalen Distending Toxins V (cdtV) betrachtet. Interessanterweise wurden alle drei untersuchten Gene in den Deletionsmutanten Δhfq und Δhns hochreguliert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen den Einfluss von globalen Regulatorproteinen auf die Genexpression von AB5 Toxinen und weisen auf eine Regulation der untersuchten Gene in einem gemeinsamen Netzwerk hin. In der zweiten Publikation wurde das Wirkprinzip der AB5 Toxine am Beispiel von Stx2a näher untersucht. Das bisher geltende Paradigma der AB5 Toxine umfasst den Wirkmechanismus der Rezeptorbindenden B-Untereinheit, welche die Aufnahme der enzymatischen A-Untereinheit und die damit verbundene Zytotoxizität vermittelt. Dieses Paradigma wurde erstmals durch vorangegangene Studien in Frage gestellt, welche die zytotoxische Aktivität der SubA-Untereinheit in Abwesenheit ihrer zugehörigen B-Untereinheit aufgezeigt hatten. In dieser Arbeit wurde geprüft, ob diese zytotoxische Aktivität der A-Untereinheit nicht nur für SubAB, sondern auch für Stx gilt. Daher wurden die Stx-Untereinheiten rekombinant exprimiert und anschließend separate His-Tag basierte Reinigungen durchgeführt. Sowohl StxA2a-His als auch StxB2a-His wurden auf ihre Zytotoxizität einzeln oder in Kombination mit der jeweils anderen Untereinheit analysiert. Auffallend war dabei die Zelltyp-unabhängige zytotoxische Aktivität der StxA2a-His Untereinheit in Abwesenheit der B-Untereinheit auf HeLa, Vero B4 und HCT-116 Zellen. Versuche mit StxB2a-His resultierten in keinerlei Zytotoxizität auf allen Zelllinien. Zusätzlich wurde die hybride Kombination aus verschiedenen Untereinheiten von SubAB1 und Stx2a untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass die durch StxA2a-His ausgelösten Effekte auf HeLa und HCT-116 Zellen durch SubB1-His reduziert wurden. Im Gegensatz dazu blieb die durch SubA1-His induzierte Zytotoxizität bei Kombination mit StxB2a-His unverändert. Diese Versuche lassen auf eine StxA2a-His Zielstruktur auf der Zelloberfläche schließen, welche durch SubB1-His blockiert wird. Zusätzliche Versuche zur Bindungskapazität der Stx2a-Untereinheiten an Gb3 zeigten, dass obwohl eine Bindung von StxB2a-His zum Rezeptor nachgewiesen wurden, keine Bindung der rekombinanten A-Untereinheit an diesen festgestellt werden konnte. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf einen zytotoxischen Effekt der StxA2a-Untereinheit in Abwesenheit ihrer B-Untereinheit auf, welcher hier als „Single-A“ Effekt bezeichnet wird. Zukünftig soll die Rolle dieses Effektes auf die Pathogenität der STEC, der Aufnahmemechanismus und der nachfolgende Transport der StxA-Untereinheit analysiert werden.
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Institute of Food Science and Biotechnology
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2022-01-18
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English
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570 Biology
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Sustainable Development Goals
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@phdthesis{Heinisch2021,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6706},
author = {Heinisch, Laura},
title = {Characterization of function and regulation of the subtilase cytotoxin and Shiga toxin of pathogenic Escherichia coli},
year = {2021},
school = {Universität Hohenheim},
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