Membrane transport and long-distance translocation of urea in Arabidopsis thaliana

Abstract

Urea is a soil nitrogen (N) form available to plant roots and a secondary N metabolite liberated in plant cells by protein degradation, especially during senescence. Despite the fact that urea also represents the most widespread form in N fertilizers used in agricultural plant production, membrane transporters that might contribute to urea uptake in plant roots or urea retranslocation in senescent leaves have so far been characterized only in heterologous systems. The first part of the thesis investigated a role of the H+/urea cotransporter AtDUR3 in N nutrition of Arabidopsis thaliana plants. T-DNA insertion lines with a defective expression in AtDUR3 showed impaired growth on urea as a sole nitrogen source. In transgenic lines expressing an AtDUR3-promoter-GFP construct, promoter activity was upregulated under N deficiency and localized to the rhizodermis, including root hairs, as well as to the cortex in more basal root zones. The AtDUR3 protein accumulated in plasma membrane-enriched protein fractions, and AtDUR3 gene expression in N-deficient roots was repressed by ammonium and nitrate but induced after supply of urea. Higher urea accumulation in roots of wild-type plants relative to the T-DNA insertion lines confirmed that urea was the transported substrate of AtDUR3. Influx of 15N-labeled urea allowed the calculation of an affinity constant of 4 µM. These results indicated that AtDUR3 is the major transporter for high-affinity urea uptake in Arabidopsis roots and suggested that the high substrate affinity of AtDUR3 reflects an adaptation to the low urea levels usually found in unfertilized soils. A physiological function of urea and its transporters in leaves was investigated in the second part of the thesis. Currently it is unclear whether transport and metabolism of urea might limit the overall retranslocation of N during senescence. AtDUR3 transcript levels were only slightly de-repressed under N starvation, but strongly increased in senescent leaves. Urea concentrations in leaf samples of different plant and leaf age showed a strong increase after plants turned into generative growth. In parallel, mRNA as much as the protein abundance of AtDUR3 increased with leaf age. The analysis of leaf petiole exudates revealed that urea was indeed a translocated N form and urea-N represented approx. 13% of the total amino acid-N irrespective of the N status of the plant. Urea concentrations determined in apoplastic wash fluids supported a role of AtDUR3 in urea retrieval from the leaf apoplast, and transgenic AtDUR3-promoter-GUS lines indicated a localization of AtDUR3 promoter activity in the vasculature of old leaves. Thus, AtDUR3 might keep internal urea in the cytosol by urea retrieval from the apoplast, allowing urea to be transported to the vascular bundle, where it is either passively loaded to the phloem or converted into amino acids for long-distance N translocation. A strong daytime-dependent phenotype with shorter leaf petioles of an Arabidopsis line overexpressing AtDUR3 led to an in silico analysis of the AtDUR3 promoter sequence revealing that salicylic acid (SA) appears to induce AtDUR3 gene expression in senescent leaves. SA is well known for its involvement in the initiation of senescence. A strongly enhanced uptake capacity for 15N-labeled urea in N-sufficient Arabidopsis roots after SA pretreatment indicated that SA might be able to mimic N-deficiency conditions, paving the way to the possibility that SA builds a regulatory link between developmental and N deficiency-induced senescence.

Harnstoff ist eine im Boden vorkommende, für Pflanzenwurzeln verfügbare Stickstoffform und ein sekundärer Stickstoffmetabolit, der durch Proteindegradation in Pflanzenzellen freigesetzt wird. Trotz der Tatsache, dass es sich bei Harnstoff um die am weitesten verbreitete Stickstoffdüngerform der agrarwirtschaftlichen Pflanzenproduktion handelt, sind Membrantransporter, die zur Harnstoffaufnahme in Pflanzenwurzeln oder zur Harnstoffretranslokation in seneszenten Blättern beitragen, bisher nur in heterologen Systemen charakterisiert. Der erste Teil der Arbeit untersucht die Rolle des H+/Harnstoff - Cotransporters AtDUR3 in der Stickstoffernährung in Arabidopsis thaliana. T-DNA Insertionslinien mit einer fehlenden Expression des AtDUR3 Gens zeigten vermindertes Wachstum, wenn Harnstoff als einzige Stickstoffquelle angeboten wurde. Die Promoteraktivität in transgenen Linien, die ein AtDUR3-promoter-GFP Konstrukt exprimieren, war unter Stickstoffmangel hochreguliert und in der Rhizodermis inklusive der Wurzelhaare lokalisiert, sowie auch im Cortex in den basaleren Wurzelzonen. Das AtDUR3 Protein wurde vorwiegend in der mit Plasmamembranen angereicherten Proteinfraktionen detektiert. In unter N-Mangel kultivierten Wurzeln war die AtDUR3 Genexpression durch Ammonium und Nitrat reprimiert, wurde aber durch Zugabe von Harnstoff induziert. Des Weiteren bestätigte eine höhere Harnstoffakkumulation in Wurzeln von Wildtyppflanzen im Vergleich zu den T DNA Insertionslinien, dass Harnstoff das transportierte Substrat von AtDUR3 war. Eine Affinitätskonstante von 4 µM konnte mithilfe von Influxexperimenten mit 15N-markiertem Harnstoff berechnet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass AtDUR3 der Haupttransporter für die hochaffine Harnstoffaufnahme in Arabidopsiswurzeln ist und weisen darauf hin, dass die hohe Substrataffinität von AtDUR3 eine Adaption an die normalerweise in ungedüngten Böden vorherrschenden niedrigen Harnstoffgehalte ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die physiologische Funktion von Harnstoff und seinen Transportern in Blättern untersucht. Derzeit ist nicht klar, ob der Transport und Metabolismus von Harnstoff die gesamte Stickstoffretranslokation während der Seneszenz limitiert. Unter Stickstoffmangel waren die AtDUR3 Transkriptmengen nur leicht de-reprimiert, stattdessen aber in seneszenten Blättern stark erhöht. Nach dem Wechsel der Pflanzen in die generative Wachstumsphase waren die Harnstoffkonzentrationen in Blattproben unterschiedlichen Pflanzen- und Blattalters stark erhöht. Parallel dazu erhöhte sich mit zunehmendem Pflanzenalter die AtDUR3 mRNA- und Proteinmenge gleichermaßen. Die Analyse von Blattstielexudaten hat gezeigt, dass Harnstoff tatsächlich eine translozierte Stickstoffform ist und Harnstoff-N circa 13% des totalen Aminosäurestickstoffs darstellt, unabhängig vom Stickstoffstatus der Pflanze. Die Harnstoffkonzentrationen im apoplastischen Wasser weisen auf eine Rolle von AtDUR3 in der Harnstoffrückgewinnung aus dem Blattapoplasten hin, und transgene AtDUR3-promoter-GUS Linien zeigten eine Lokalisation der AtDUR3 Promoteraktivität nahe der und im Leitbündel von alten Blättern. Demnach hält AtDUR3 vermutlich den internen Harnstoff durch Harnstoffrückgewinnung aus dem Apoplasten im Zytosol, damit er in die Nähe des Leitgewebes transportiert werden kann. Dort wird er entweder passiv ins Phloem geladen oder für den Langstreckentransport von Stickstoff in Aminosäuren umgewandelt. Eine AtDUR3-Überexpressionslinie in Arabidopsis, die einen stark tageszeiten-abhängigen Phänotyp mit kürzeren Blattstielen zeigt, führte zu einer in silico Analyse der AtDUR3 Promotersequenz. Diese zeigte, dass Salizylsäure (SA) für die AtDUR3 Geneinduktion in seneszenten Blättern benötigt zu werden scheint. SA ist bekannt für seine Beteiligung an der Initialisierung der Seneszenz. Eine stark erhöhte 15N Harnstoffaufnahme nach SA-Vorbehandlung in mit ausreichend Stickstoff versorgten Arabidopsiswurzeln impliziert, dass SA in der Lage ist, Stickstoffmangelbedingungen zu imitieren. Damit könnte SA die Verbindung zwischen der Regulation der entwicklungsbedingten und der stickstoffmangelinduzierten Seneszenz sein.