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Abstract (English)
Lactobacilli are Gram-positive bacteria used throughout the food industry as traditional starters for various fermented foods. Lactobacilli would be superior for recombinant enzyme production regarding the food safety demands since most of them are Generally Recognised As Safe (GRAS) organisms. The major advantages of Lactobacilli as food-associated microorganisms used for recombinant enzyme production are their safe and sustainable use as overall safety food-grade expression systems. In the work presented, Lactobacilli were studied in detail as food-grade expression systems for recombinant enzyme production. In a first analysis, the two pSIP expression systems, pSIP403 and pSIP409, were investigated to produce a hyper-thermophilic Beta-glycosidase (CelB) from Pyrococcus furiosus in Lactobacillus plantarum NC8 and Lactobacillus casei as hosts, respectively. Both Lactobacilli harbouring the pSIP409-celB vector produced active CelB in batch bioreactor cultivations, while the specific CelB activity of the cell-free extract was about 44% higher with Lb. plantarum (1,590 ± 90 nkatpNPGal/mgprotein) than with Lb. casei (1,070 ± 66 nkatpNPGal/mgprotein). A fed-batch bioreactor cultivation of Lb. plantarum NC8 pSIP409-celB resulted in a specific CelB activity of 2,500 ± 120 nkatpNPGal/mgprotein. A basal whey medium with supplements was developed as an alternative to the cost intensive MRS medium used. About 556 ± 29 nkat pNPGal/mgprotein of CelB activity was achieved in bioreactor cultivations using this medium. It was shown that both Lactobacilli were potential expression hosts for recombinant enzyme production.
An additional approach was performed to produce a metagenome-beta-galactosidase using Lb. plantarum NC8 with the pSIP expression system. Using this system, a quite low maximal galactosidase activity of only 0.18 nkatoNPGal/mgprotein was detected. A 13 times higher activity of 2.42 nkatoNPGal/mgprotein was produced after the knock out of the interfering native Kluyveromyces lactis Beta-galactosidase in the well-known food-grade K. lactis pKLAC2 expression system. Nevertheless, the best performing expression system for the recombinant production of the metagenome-derived enzyme was the Escherichia coli BL21 strain with a pET vector, resulting in the highest Beta-galactosidase of 82.01 nkatoNPGal/mgprotein.
Beside the use of the pSIP expression system, a novel expression system for Lb. plantarum was developed. This system is based on the manganese starvation-inducible promoter from the specific manganese transporter of Lb. plantarum NC8 which was cloned for the first time. The expression of CelB was achieved by cultivating Lb. plantarum NC8 at low manganese concentrations with MRS medium and the pmntH2-celB expression vector. A CelB activity of 8.52 µkatoNPGal/L was produced in a bioreactor. The advantages of the novel expression system are that no addition of an external inducing agent was required, and additionally, no further introduction of regulatory genes was necessary. The new promoter meets the general demands of food-grade expression systems.
The glutamic acid racemase of Lb. plantarum NC8 was cloned and characterized in this work for the first time as a possible target for a food-grade selection system for this species. Glutamic acid racemases (MurI, E.C. 5.1.1.3) catalyse the racemisation of L- and D-glutamic acid. MurIs are essential enzymes for bacterial cell wall synthesis, which requires D-glutamic acid as an indispensable building block. Therefore, these enzymes are suitable targets for antimicrobial drugs as well as for the potential design of auxotrophic selection markers. A high expression system in E. coli BL21 was constructed to produce and characterize the biochemical properties of the MurI from Lb. plantarum NC8. The recombinant, tag-free Murl was purified by an innovative affinity chromatography method using L-glutamic acid as the relevant docking group, followed by an anion exchange chromatography step (purification factor 9.2, yield 11%). This two-step purification strategy resulted in a Murl sample with a specific activity of 34.06 µkatD-Glu/mgprotein, comprising a single protein band in SDS-PAGE. The purified Murl was used for biochemical characterization to gain in-depth knowledge about this enzyme. Only D- and L-glutamic acid were recognised as substrates for the Murl with similar kcat/Km ratios of 3.6 sec-1/mM for each enantiomer.
The findings in this study may contribute to further development and implementation of food-grade Lactobacilli expression systems for recombinant enzyme production. Furthermore, the results obtained may help to optimise and select hosts and expression systems for industrial enzyme production for the needs of the food industry.
Abstract (German)
Lactobacilli sind Gram-positive Bakterien, deren Einsatz als traditionelle Starterkulturen für verschiedenste Nahrungsmittel in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet ist. Als GRAS-Organismen (generally recognised as safe´´) eignen sie sich hinsichtlich Lebensmittelsicherheit hervorragend zur rekombinanten Enzymproduktion. Sie bieten als lebensmittelassoziierte Mikroorganismen große Vorteile für die rekombinante Enzymproduktion, da sie als sogenannte food-grade´´ Expressionssysteme sicher und nachhaltig eingesetzt werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einsatz von Lactobacilli als food-grade Expressionssysteme für rekombinante Enzymproduktionen detailliert zu analysieren.
In ersten Untersuchungen wurde dafür das pSIP Expressionssystem mit den Vektoren pSIP403 und pSIP409 zur rekombinanten Produktion der hyper-thermophilen Beta-Glucosidase (CelB) aus Pyrococcus furiosus in Lactobacillus plantarum NC8 und Lactobacillus casei als Wirtsorganismen genutzt. Mit beiden Organismen konnte mit dem Vektor pSIP409-celB in Bioreaktor-Kultivierungen im Batch-Verfahren aktives Enzym produziert werden. Mit Lb. plantarum wurde dabei eine um 44% höhere CelB-Aktivität (1.590 ± 90 nkatpNPGal/mgProtein) im Vergleich zu Lb. casei (1.070 ± 66 nkatpNPGal/mgProtein) generiert. Durch ein Fed-Batch-Verfahren gelang es, die spezifische CelB-Aktivität im Bioreaktor mit Lb. plantarum auf ein Maximum von 2.500 ± 120 nkatpNPGal/mgProtein zu steigern. Als Alternative zu dem genutzten kostenintensiven MRS-Medium wurde ein basales Molkemedium mit Zusätzen entwickelt. Unter Verwendung dieses Mediums wurde eine maximale spezifische CelB-Aktivität von 556 ± 29 nkat pNPGal/mgProtein im Bioreaktor erzielt. Somit konnte gezeigt werden, dass sich Lactobacilli grundsätzlich als potentielle food-grade Expressionssysteme zur rekombinanten Enzymproduktion eignen.
In weiteren Untersuchungen erfolgte die Produktion einer Metagenom-beta-Galactosidase mit Lb. plantarum und dem pSIP409 Expressionssystem. Unter Nutzen dieses Systems konnte eine geringe maximale Beta-Galactosidase-Aktivität von nur 0,18 nkatoNPGal/mgProtein detektiert werden. Eine 13-fach höhere Aktivität der Metagenom-beta-Galactosidase konnte in dem food-grade Expressionssystem Kluyveromyces lactis unter Verwendung des pKLAC2 Vektors, nach knock-out der störenden nativen Beta-Galactosidase, generiert werden. Als leistungsfähigstes Expressionssystem zur rekombinanten Produktion dieses Enzyms stellte sich in weiteren Experimenten Escherichia coli BL21 mit pET Vektor heraus, dessen Einsatz zu der höchsten Beta-Galactosidase-Aktivität von 82,01 nkatoNPGal/mgProtein führte.
Zusätzlich zu dem genutzten pSIP System erfolgte die Entwicklung eines neuen Expressionssystem für Lb. plantarum NC8. Dieses Expressionssystem basiert auf dem Manganmangel-induzierbaren Promotor eines spezifischen Mangantransporter-Proteins von Lb. plantarum, welcher erstmalig zur rekombinanten Proteinproduktion genutzt wurde. Eine Expression der CelB konnte bei Kultivierung von Lb. plantarum mit dem pmntH2-celB Expressionsvektor in MRS-Medium bei niedrigen Mangankonzentrationen nachgewiesen werden. Es wurde in Bioreaktor-Kultivierungen eine maximale CelB Aktivität von 8,52 µkatoNPGal/L erzielt. Die Vorteile dieses neuen Promotorsystems bestehen darin, dass keine Zugabe eines externen Induktors notwendig ist und dass keine weiteren regulatorischen Gene in den Wirtsorganismus eingebracht werden müssen. Somit erfüllt dieser neue Promotor die generellen Anforderungen an ein food-grade Expressionssystem.
In weiteren Arbeiten wurde die Glutaminsäure-Racemase von Lb. plantarum als möglicher food-grade Selektionsmarker in der vorliegenden Studie erstmalig kloniert und charakterisiert. Glutaminsäure-Racemasen (MurI, E.C. 5.1.1.3) katalysieren die Racemisierung von L- und D-Glutaminsäure und sind essentielle Enzyme für den bakteriellen Zellwandaufbau. Daher eignen sie sich als mögliche Ziele für antimikrobielle Arzneimittel sowie zur Konstruktion möglicher auxotropher Selektionsmarker. Nach rekombinanter Expression der MurI von Lb. plantarum NC8
in E. coli BL21 wurde das rekombinante Enzym durch eine Affinitätschromatographie mit L-Glutaminsäure und folgender Anionenaustausch-chromatographie gereinigt (Reinigungsfaktor 9.2, Ausbeute 11%). Dies resultierte in einer spezifischen MurI-Aktivität von 34,06 µkatD-Glu/mgProtein, und einer Einzelbande in der SDS-PAGE-Analyse. Eine detaillierte biochemische Charakterisierung zeigte unter anderem, dass nur D- und L-Glutaminsäure als Substrate mit gleichem kcat/Km von 3,6 sec-1/mM von der MurI akzeptiert werden.
Die Resultate dieser Arbeit können für eine Weiterentwicklung und Implementierung von food-grade Lactobacilli Expressionssystemen von rekombinanten Enzymen beitragen. Außerdem können die erzielten Erkenntnisse zukünftig helfen, Wirts- und Expressionssysteme für die industrielle Enzymproduktion gemäß den Anforderungen der Lebensmittelindustrie auszuwählen und zu optimieren.
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Faculty
Faculty of Natural Sciences
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Institute of Food Science and Biotechnology
Examination date
2013-11-07
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English
Publisher
Publisher place
Classification (DDC)
570 Biology
Original object
Sustainable Development Goals
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@phdthesis{Böhmer2013,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5775},
author = {Böhmer, Nico},
title = {Food-grade Lactobacilli expression systems for recombinant enzymes},
year = {2013},
school = {Universität Hohenheim},
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