Membraneinbau von MscL und MscL-Mutanten aus Escherichia coli

Abstract

About one third of all synthesized proteins in a cell are membrane proteins. To accomplish their function, it is important to ensure, that they safely reach their destination, insert efficiently into the membrane, where they fold into their correct tertiary structure. Previous studies have shown that various molecules are responsible for the targeting and insertion of membrane proteins in Escherichia coli that operate as individual modules. The mechanosensitive channel MscL is a pentameric complex in the cytoplasmic membrane of E. coli. By its action as a safety valve, MscL allows the adaption to hypoosmotic conditions of bacteria living under varying circumstances. The two transmembrane segments of the MscL monomer are connected by a periplasmic loop of 29 amino acid residues. In previous studies, the membrane insertion of MscL was analyzed in vivo in depletion strains and was monitored by modification of a single cysteine residue in the periplasmic domain of the MscL protein (Facey et al., 2007). The targeting of MscL to the inner membrane occurs in a cotranslational manner via the signal recognition particle (SRP). At the membrane, the MscL protein inserts independently of the membrane potential and the Sec-components SecAYEG, but requires YidC for the insertion process. The present thesis is about the molecular mechanisms regarding the decision whether the nascent polypeptide chain of MscL is recognized and bound by YidC or by the Sec-translocase. The periplasmic localized loop of MscL was altered by introducing negatively or positively charged residues as well as uncharged side chains and the effects on the translocation were investigated. Translocation of the periplasmic domain of MscL was detected using AMS-derivatization (4-acetamido-4´-maleimidylstilbene-2, 2´-disulfonic acid) of a single cysteine residue. The extension of the loop region by one, two or three negatively charged residues (aspartic acid residues) made the insertion of MscL dependent on the membrane potential and the Sec translocon. The requirement of SecYE was gradually affected by increasing the number of charged residues. Efficient translocation of the periplasmic loop with three additional uncharged (asparagines) residues also required the Sec-complex. The insertion of these MscL mutants was independent on the SecA component, but all the investigated mutants still showed a strict dependence on YidC. The ability of the altered MscL proteins to form functional pentameric channels was verified by growth tests and native gel electrophoresis. The presence of three additional positively charged arginine residues in the periplasmic domain inhibited MscL insertion into the lipid bilayer as well as the mutant with five additional negatively charged aspartic acid residues. As a logical consequence, the expression of these two MscL proteins could not protect the cells from osmolysis within growth tests. The direct involvement of the membrane insertase YidC with MscL and the MscL mutants was corroborated with in vivo crosslinking. YidC interacts with both transmembrane regions of MscL. Earlier studies have shown that YidC makes contact with the Pf3 coat protein in the center of the membrane. Here, the same interaction sites of YidC were identified contacting MscL during its insertion. Besides considering the significance of YidC for efficient membrane insertion, the present work has demonstrated that YidC is also essential for oligomerization of MscL into a functional channel.

Etwa ein Drittel aller in der Zelle synthetisierten Proteine sind Membranproteine. Um ihre Funktion zu erfüllen, muss gewährleistet werden, dass sie ihren Zielort sicher erreichen, effizient in die Membran inserieren und dort ihre korrekte Tertiärstruktur annehmen. Intensive Studien haben gezeigt, dass in Escherichia coli verschiedene Faktoren für die Zielsteuerung und Insertion von Membranproteinen verantwortlich sind und diese als individuelle Module agieren. Der mechanosensitive Kanal MscL ist ein pentamerer Komplex in der Cytoplasmamembran von E. coli. Als Überdruckventil stellt MscL die Anpassung, der bei unterschiedlichen Umweltbedingungen lebenden Bakterien, an hypoosmotische Stresssituationen sicher. Die zwei Transmembranbereiche des MscL-Monomers sind durch einen periplasmatischen Loop mit einer Länge von 29 Aminosäuren miteinander verbunden. Zunächst wurde der Membraneinbau von MscL anhand von Depletionsstämmen in vivo untersucht (Facey et al., 2007). Durch Derivatisierung eines im periplasmatischen Bereich des MscL-Proteins befindlichen Cysteinrests konnte die Membraninsertion verfolgt werden. Die cotranslationale Zielsteuerung von MscL an die Innenmembran wird über das Signal recognition particle (SRP) vermittelt. Dort inseriert das MscL-Protein unabhängig vom Membranpotential und den Komponenten der Sec-Translokase SecAYEG, YidC ist jedoch für den Insertionsprozess essentiell. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den molekularen Mechanismen, die der Entscheidung zugrunde liegen, ob die naszierende Polypeptidkette des MscL-Proteins von YidC oder von der Sec-Translokase erkannt und gebunden wird. Zu diesem Zweck wurde der im Periplasma lokalisierte Loop von MscL durch Einfügen negativer oder positiver Ladungen sowie neutraler Aminosäuren verändert und die Auswirkungen auf die Insertion untersucht. Durch Verlängerung des periplasmatischen Bereichs um eine, zwei oder drei negative Ladungen (Aspartatreste) wurde die Insertion von MscL vom Membranpotential und der Sec-Translokase abhängig. Mit jeder zusätzlichen Ladung nahm auch die Abhängigkeit von SecYE zu. Für eine effiziente Translokation des Loops mit drei zusätzlichen, neutralen Aminosäuren (Asparagine) war der Sec-Komplex ebenfalls erforderlich. Für die Insertion dieser MscL-Mutanten war SecA nicht notwendig, jedoch waren alle analysierten MscL-Proteine weiterhin strikt YidC-abhängig. Die Fähigkeit dieser veränderten MscL-Proteine funktionelle Pentamere zu bilden, wurde anhand von Wachstumsversuchen und nativer Gelelektrophorese bestätigt. Die Anwesenheit von drei zusätzlichen positiven Argininen sowie von fünf zusätzlichen negativen Aspartaten im periplasmatischen Loop von MscL verhinderte den Einbau in die Lipidschicht. Als logische Konsequenz konnte die Expression dieser beiden MscL-Proteine in Wachstumsversuchen auch keinen Schutz vor osmotisch bedingter Lyse gewährleisten. Eine direkte Interaktion von MscL und den funktionellen MscL-Mutanten mit der Membraninsertase YidC wurde durch in vivo Quervernetzungsexperimente verifiziert. Dabei interagiert YidC mit beiden Transmembranbereichen von MscL. Die Kontaktstellen in YidC entsprachen den bereits für Pf3 coat gezeigten Positionen im zentralen Bereich der Membran. Neben der Bedeutung von YidC für eine effiziente Membraninsertion konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von MscL zu einem funktionellen Kanal ebenfalls nur in Anwesenheit von YidC stattfindet.