Funktionelle Untersuchung der Sensorkinase KdpD von Escherichia coli mit Hilfe verschiedener KdpD-Deletionsmutanten

Abstract

The high affinity K+ transport system KdpFABC is one of several uptake systems that accumulate K+ in Escherichia coli. Expression of the kdpFABC operon is under control of the regulatory proteins KdpD and KdpE, which constitute a typical sensor kinase/response regulator system. KdpD is an integral protein of the cytoplasmic membrane. The N-terminal domain, the 4 helices and 200 amino acids of the cytoplasmic C-terminal domain are accredited to be involved in the signal input function. Surprisingly, a mutant (KdpD-C) lacking the N-terminal domain, helix 1 and 2 is a functional K+ sensor, which is able to detect the changes in K+ concentration in the medium. To investigate which parts of the KdpD protein are essential for signal transduction, various truncated KdpD variants were constructed and analyzed. The results show that the fragment C499-894, which contains only the cytoplasmic C-terminal domain of KdpD, is able to recognise the increase in K+ concentration in medium and reduce the level of activity. This mini sensor is also able to discriminate between Li+, Rb+ and K+ ions like the wild-type KdpD. A plasmid coding for this mini sensor allows a kdpD deletion strain to grow under K+-limited conditions in medium. Presumably, the signal perceived by KdpD is in the periplasm, but how is the signal transmitted to the cytoplasmic domain of KdpD that controls activity? Perhaps KdpD is not the direct sensor, an additional component in the membrane might sense the signal and communicate with KdpD. Further research with sodium carbonate extraction to determine the membrane localisation of C499-894 showed the protein mainly found in the supernatant, suggesting C499-894 is a soluble protein, although C499-894 could be attached to the membrane to come in contact with an unknown membrane protein. Looking for the unknown component two protein candidates were found by co-purification, the cytochrome oxidase A (CyoA) and the glucosamine-6-phosphate synthase (GlmS). To find an interaction between these proteins and KdpD more research has to be done.

Das hochaffine K+-Transportsystem KdpFABC ist eines der Aufnahmesysteme, das in Escherichia coli K+ akkumuliert. Die Expression des kdpFABC Operons steht unter der Kontrolle der regulatorischen Proteine KdpD und KdpE, die ein typisches Sensorkinase/Antwortregulator-System darstellen. KdpD ist ein integrales Protein in der cytoplasmatischen Membran. Der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne und den transmembranen Helices von KdpD wurden bisher die Funktion des Signal-?inputs? zugeschrieben. Überraschend war daher der Befund, dass eine Komplettdeletion der N-terminalen Domäne und der ersten beiden Helices (KdpD-C) ein voll funktionsfähigen Sensor darstellt, der auf Änderungen der K+-Konzentration im Medium reagiert. Es wurden sodann weitere Teile von KdpD-C deletiert, um den Bereich in KdpD genau zu definieren, der für die Signaltransduktion verantwortlich ist. Die Untersuchungen dieser Arbeit haben gezeigt, dass das KdpD-Konstrukt C499-894, das nur noch aus der cytoplasmatischen, löslichen Domäne besteht, in der Lage ist eine Erhöhung der K+-Konzentration im Medium zu registrieren und mit einer Reduzierung der Aktivität reagiert. Der minimale Sensor differenziert zwischen Li+, Rb+ und K+ Ionen, ebenso wie der Wildtyp. Ein Plasmid, das für den minimalen Sensor codiert, erlaubt einem kdpD-Deletionsstamm das Wachstum unter Kalium limitierten Bedingungen im Medien. Vermutlich ist das Signal, das von KdpD wahrgenommen wird, im Periplasma. Aber wie wird das Signal zu der cytoplasmatische C-terminalen Domäne, die bei der Regulierung der Aktivität involviert ist, übertragen? Eventuell ist KdpD ist nicht der direkte Sensor und bekommt die Änderungen in der K+-Konzentration von einem weiteren Protein in der Membran übermittelt. Weitere Untersuchungen zur Membranlokalisation mit der Natrium-Carbonat-Methode haben gezeigt, dass C499-894 hauptsächlich im Überstand, dass heißt in der löslichen Form vorkommt. Dies schließt nicht aus, dass C499-894 sich nicht an die Membran anlagert und so eventuell mit einem unbekannten Protein interagiert. Bei der Suche nach diesem unbekannten Protein wurden zwei eventuelle Kandidaten ermittelt, die Cytochromoxidase A (CyoA) und die Glucosamin-6-phosphat-Synthase (GlmS). Ob diese Proteine wirklich mit KdpD interagieren muss noch nachgewiesen werden.