Functional characterization of the COOH-terminal kinase activity of the TBP-associated factor TAF1

Abstract

Activation of eukaryotic transcription involves an orchestrated interplay between transcription factors and the general RNA polymerase II (Pol II) transcription machinery (GTM), which consists of Pol II and general transcription factors (GTFs). The GTF TFIID consists of the TATA-box binding protein (TBP) and several TBP-associated factors (TAFs). The binding of TFIID to promoters can nucleate transcription. TAF1 is the largest subunit of TFIID and plays a central role within the nucleating function of TFIID in transcription. TAF1 mediates the binding of TFIID to promoters and interacts with enhancer-bound transcription factors and several GTFs. Additionally, TAF1 contains four enzymatic activities that are essential for viability of eukaryotes and mediate posttranslational modification of GTFs and histones. TAF1 is a bipartite protein kinase and contains an NH2-terminal kinase domain (NTK) and a COOH-terminal kinase domain (CTK). A previous study demonstrated that the CTK phosphorylates serine-residue 33 in histone H2B (H2BS33). However, the role of TAF1-mediated phosphorylation in transcription regulation remained unknown. In this study, the functional importance of H2BS33 phosphorylation (H2BS33P) by TAF1 was investigated by using a combination of biochemical and in vivo assays. In vitro kinase assays uncovered the two essential kinase motifs in TAF1CTK, the ATP-binding motif and the serine/threonine-specific catalytic motif, and indicate that the TAF1 CTK has intrinsic kinase-activity. Western blot analysis using an antibody to H2BS33P revealed that H2BS33 is phosphorylated in Drosophila. RNA-interference (RNAi) assays, designed to attenuate TAF1 expression (TAF1RNAi), revealed that TAF1 is a major kinase for H2BS33 in Drosophila Schneider cells. Flow-cytometry analysis of TAF1RNAi cells indicated that loss of TAF1 expression results in cell cycle arrest in G2/M-phase. Screening the transcription of cell cycle genes in TAF1RNAi cells by using reverse-transcriptase-PCR demonstrated that the transcription of the cell cycle gene string (stg) is reduced in the absence of TAF1. Chromatin immunoprecipitation assays (XChIP) indicate that H2BS33P is detectable at the transcriptionally active stg promoter but not at the silent stg promoter in TAF1RNAi cells. These results demonstrate that phosphorylation of H2BS33 is involved in stg transcription. XChIP-assays using chromatin prepared from Drosophila embryos, which express a mutant TAF1 lacking the CTK, revealed that CTK-mediated phosphorylation of H2BS33 plays an essential role in the activation of transcription of the Drosophila segmentation gene giant. In vitro kinase assays demonstrate that Bdf1 and Bdf2, the yeast homologues of the TAF1CTK, phosphorylate histones suggesting that the kinase activity of the TAF1CTK is phylogenetically conserved. The results of this work demonstrate that TAF1CTK is a major histone kinase of H2BS33 and that TAF1-mediated phosphorylation of H2BS33 plays an essential role in the transcription events during cell cycle progression and development.

Die Aktivierung eukaryotischer Transkription umfaßt eine geordnete Interaktion zwischen Transkriptionsfaktoren und der generellen RNA Polymerase II (Pol II) Transkriptionsmaschinerie (GTM), welche aus Pol II und generellen Transkriptions-Faktoren (GTFs) gebildet wird. Der GTF TFIID besteht aus dem TATA-Box-bindenden Protein (TBP) und mehreren TBP-assoziierten Faktoren (TAFs). Die Bindung von TFIID an Promotoren kann Transkription nukleieren. TAF1 ist die größte Untereinheit von TFIID und spielt eine zentrale Rolle bei der nukleierenden Funktion von TFIID in Transkription. TAF1 vermittelt die Bindung von TFIID an Promotoren und interagiert mit Enhancer-gebundenen Transkriptionsfaktoren sowie mehreren GTFs. Desweiteren enthält TAF1 vier enzymatische Aktivitäten, welche essentiell für die Entwicklung von Eukaryoten sind und posttranslationelle Modifikationen von GTFs und Histonen vermitteln. TAF1 ist eine zweiteilige Proteinkinase und enthält eine NH2-terminale Kinasedomäne (NTK) sowie eine COOH-terminale Kinasedomäne (CTK). Eine frühere Studie zeigte daß die CTK Serin 33 in Histon H2B (H2BS33) phosphorylieren kann. Welche Rolle die TAF1-vermittelte Phosphorylierung in der Transkription spielt, blieb jedoch unbeantwortet. In dieser Studie wurde die funktionelle Bedeutung der Phosphorylierung von H2BS33 (H2BS33P) durch TAF1 mittels Kombination von biochemischen Assays und Experimenten in vivo untersucht. Mit Hilfe von in vitro Kinase-Assays wurden die zwei essentiellen Kinasemotive in TAF1CTK, das ATP-bindende Motiv und das Serin/Threonin-spezifische katalytische Motiv, aufgedeckt und gezeigt, daß TAF1CTK intrinsische Kinaseaktivität besitzt. Western-Blot-Analysen mit Antikörpern gegen H2BS33P zeigen, daß H2BS33 in Drosophila phosphoryliert ist. RNA-Interferenz Experimente (RNAi), welche eine Abschwächung der Expression von TAF1 bewirkten, zeigen, daß TAF1 eine bedeutende Kinase für H2BS33 in Drosophila Schneider-Zellen darstellt. Durchflußzytometrische Analysen von TAF1RNAi-Zellen ergaben, daß die Reduzierung der Expression von TAF1 einen Zellzyklusarrest in G2/M-Phase bewirkt. Ein Screening der Transkription von Zellzyklusgenen in TAF1RNAi-Zellen zeigte, daß die Transkription des Zellzyklusgens string (stg) in der Abwesenheit von TAF1 reduziert ist. Chromatin Immunopräzipitierungsassays (XChIP) detektierten H2BS33P am transkriptionell aktiven stg promoter, jedoch nicht am transkriptionell inaktiven stg promoter in TAF1RNAi-Zellen. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die Phosphorylierung von H2BS33 an der Transkription von stg beteiligt ist. XChIP-Assays mit Chromatin aus Drosophila Embryos, welche eine TAF1-Mutante ohne CTK exprimieren, deckten außerdem auf, daß die CTK-vermittelte Phosphorylierung von H2BS33 eine essentielle Rolle bei der Transkriptionsaktivierung des Drosophila Segmentierungsgens giant spielt. In vivo Kinase-Assays zeigen daß Bdf1 und Bdf2, Homologe von TAF1CTK in Hefe, Histone phosphorylieren und legen nahe, daß die Kinaseaktivität von TAF1CTK phylogenetisch konserviert ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit charakterisieren TAF1CTK als eine bedeutende Histonkinase von H2BS33 und zeigen daß die TAF1-vermittelte Phosphorylierung von H2BS33 eine bedeutende Rolle in der Transkription zellzyklus- und entwicklungsspezifischer Gene spielt.