The Bacillus phage SPβ : a model system to study the lysis-lysogeny regulatory network and antiphage defense systems

Abstract

Although bacteriophages are considered the most abundant biological entities on our planet, they are less well-studied compared to their host. Being intracellular parasites, phages rely on the metabolic processes of their bacterial hosts for their replication. Phages that use the host exclusively to produce virions are called virulent phages and the reproduction cycle is called the lytic cycle. The lytic cycle is accompanied by lysis and, thus, the killing of the host cell. Temperate phages can choose between the virulent or lysogenic lifecycle. Lysogeny or the lysogenic cycle is a type of viral reproduction in which no virus particles are produced, instead, the genetic material of the phage is replicated and then passed on to the daughter cells. The viral genome can be present as part of the bacterial chromosome or as a circular or linear plasmid molecule and is referred to as a prophage. Since temperate phages can influence the mutual interactions with other bacteria, growth, metabolic pathways or pathogenicity of their host, it is important to understand how temperate phages control their lysogenic life cycle and which genes are involved. Repression usually occurs through the interaction between a repressor and specific binding sites, which are mostly located in the promoter regions of the lytic genes.

SPβ is a temperate phage of the model bacterium Bacillus subtilis. In contrast to its host, many aspects of the life cycle of SPβ have been little studied and many genes have not been assigned a function. Not only are SPβ-like phages widespread within the genus Bacillus and of greater importance to their hosts than previously thought, but they also exhibit a novel lysogeny management system. With regard to the control and regulation of the lysis-lysogeny network, it is already partially known which gene products are involved in the decision, establishment and resolvement of lysogeny. The maintenance and resolvement of lysogeny of SPβ was investigated in more detail in this thesis. To gain more insight into the regulation and control of lysogeny, the SPβ c2 mutant was characterized in this work. This mutant is unable to maintain its lysogenic state when exposed to heat, suggesting the alteration of a key regulatory element. This work demonstrated that the SPβ c2 phenotype is due to a single nucleotide exchange in the mrpR (yopR) gene that renders the encoded MrpRG136E protein temperature-sensitive. Furthermore, it was shown that this protein acts as a repressor of lytic gene expression. This occurs through the binding of the repressor to several conserved elements in the genome of the SPβ prophage. Further biochemical analysis revealed that the G136E exchange makes MrpR less stable and reduces its affinity for DNA binding. Structural characterization of MrpR revealed that the protein is a DNA-binding protein with a similar protein fold to tyrosine recombinases. However, the repressor function is independent of functional recombinase activity. In addition, a mutagenesis approach was used to identify the region within the protein that is essential for the function of the repressor. This work also identified further players in the lysogeny management system, with the YosL protein being crucial for the induction of the lytic cycle. However, YosL cannot activate the lytic cycle of SPβ alone. In addition, the core genome of SPβ-like phages was defined and new integration loci were identified in this work.

Apart from a better understanding of lysis-lysogeny regulation and phagehost relationships, the characterization of the SPβ c2 mutant also led to the identification of a previously unknown phage defense system. The defense system is encoded on a plasmid and leads to a decrease in phage titer and a change in plaque morphology. It could be shown that the spbB locus, which ensures the segregation stability of the plasmid and codes for two open reading frames, is also responsible for the resistance to SPβ c2 and related phages. Further studies have shown that the spbB gene and the downstream region, which presumably encodes an RNA element and a terminator, play a crucial role in mediating resistance. The second open reading frame of the spbB locus is irrelevant for the mediation of phage resistance. Overall, this work contributes to a better understanding of the phage-host relationship.

Obwohl Bakteriophagen als die am häufigsten vorkommende biologische Einheit auf unserem Planeten gelten, sind sie im Vergleich zu ihrem Wirt weniger gut erforscht. Als intrazelluläre Parasiten sind Phagen für ihre Vermehrung auf die Stoffwechselprozesse ihrer bakteriellen Wirte angewiesen. Phagen, die den Wirt ausschließlich dazu nutzen, Virionen zu produzieren, werden als virulente Phagen bezeichnet und der Reproduktionszyklus als lytischer Zyklus. Der lytische Zyklus geht mit der Lyse und damit dem Tod der Wirtszelle einher. Temperente Phagen können zwischen dem virulenten und dem lysogenen Lebenszyklus wechseln. Die Lysogenie beziehungsweise der lysogene Zyklus ist eine Art der viralen Reproduktion, bei der keine Viruspartikel produziert werden, sondern nur das genetische Material des Phagens repliziert und dann entsprechend an die Tochterzellen weitergegeben wird. Das virale Genom kann als Teil des bakteriellen Chromosoms oder als zirkuläres oder lineares Plasmidmolekül vorliegen und wird als Prophage bezeichnet. Da temperente Phagen die wechselseitigen Interaktionen mit anderen Bakterien, das Wachstum, Stoffwechselwege oder die Pathogenität ihres Wirtes beeinflussen können, ist es wichtig zu verstehen, wie temperente Phagen ihren lysogenen Lebenszyklus steuern und welche Gene daran beteiligt sind. Der lysogene Zyklus durchläuft verschiedene Phasen: Entscheidung, Etablierung, Aufrechterhaltung und Auflösung. Der lysogene Zustand eines Prophagen wird durch die Repression lytischer Gene aufrechterhalten. Die Repression erfolgt in der Regel durch die Wechselwirkung zwischen einem Repressor und spezifischen Bindestellen, welche sich in den Promoter-Bereichen der lytischen Gene befinden.

SPβ ist ein temperenter Phage des Modellbakteriums Bacillus subtilis. Im Gegensatz zu seinem Wirt wurden viele Aspekte des Lebenszyklus von SPβ wenig untersucht und vielen Genen konnte noch keine Funktion zugeordnet werden. SPβ-ähnliche Phagen sind nicht nur innerhalb der Gattung Bacillus weit verbreitet und für ihre Wirte von größerer Bedeutung als bisher angenommen, sondern besitzen auch ein neuartiges Lysogenie- Management-System. Im Hinblick auf die Steuerung und Regulation des Lysis-Lysogenie-Netzwerks ist bereits teilweise bekannt, welche Genprodukte an der Entscheidung, Etablierung und Auflösung der Lysogenie beteiligt sind. Die Aufrechterhaltung und Auflösung der Lysogenie von SPβ wurde in dieser Arbeit näher betrachtet und untersucht. Um mehr Einblicke in die Regulation und Steuerung der Lysogenie zu erhalten, wurde in dieser Arbeit SPβ c2-Mutante untersucht und charakterisiert. Diese Mutante kann ihren lysogenen Zustand bei Hitzeeinwirkung nicht aufrechterhalten, was auf die Veränderung eines zentralen regulatorischen Elements schließen lässt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der SPβ c2-Phänotyp auf einen einzelnen Nukleotidaustausch im mrpR (yopR)-Gen zurückzuführen ist, der das kodierte MrpRG136E-Protein temperaturempfindlich macht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass dieses Protein als Repressor der lytischen Genexpression fungiert. Dies geschieht durch die Bindung des Repressors an mehrere konservierte Elemente im Genom des SPβ-Prophagen. Weiterführende biochemische Analysen ergaben, dass der G136E-Austausch das MrpR-Protein weniger stabil macht und seine Affinität zur DNA verringert. Die strukturelle Charakterisierung von MrpR ergab, dass das Protein ein DNA-bindendes Protein ist und eine ähnliche Proteinfaltung wie Tyrosin-Rekombinasen aufweist. Allerdings ist die Repressorfunktion unabhängig von einer funktionellen Rekombinase- Aktivität. Zusätzlich konnte mit der Hilfe eines Mutageneseansatzes die Region innerhalb des Proteins identifiziert werden, die für die Funktion des Repressors wesentlich ist. In dieser Arbeit konnten zudem weitere Akteure des Lysogenie-Management-Systems identifiziert werden, wobei das YosL-Protein für die Induktion des lytischen Zyklus entscheidend ist. Das Protein allein kann jedoch den lytischen Zyklus von SPβ nicht aktivieren. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Kerngenom der SPβ-ähnlichen Phagen definiert, sowie neue Integrationsloci gefunden, was zu einem besseren Verständnis der Phagen-Wirt-Beziehung beiträgt.

Neben einem besseren Verständnis der Lysis-Lysogenie-Regulation und der Phagen-Wirts-Bezie-hungen führte die Charakterisierung der SPβ c2- Mutante auch zur Identifizierung eines bisher unbekannten Phagenabwehrsystems. Das Abwehrsystem ist auf einem Plasmid kodiert und führt zur Absenkung des Phagen-Titers und zu einer Veränderung der Plaque-Morphologie. Es konnte gezeigt werden, dass der spbB-Lokus, welcher die Segregationsstabilität des Plasmids gewährleistet und für zwei offene Leserahmen codiert, ebenfalls für die Resistenz gegen SPβ c2 und verwandte Phagen verantwortlich ist. Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass das spbB-Gen und die stromabwärts liegende Region, welche vermutlich für ein RNA-Element und einen Terminator kodiert, eine entscheidende Rolle bei der Resistenzvermittlung spielen. Der zweite offene Leserahmen des spbB-Lokus ist für die Vermittlung der Phagenresistenz ohne Bedeutung. Insgesamt trägt die Arbeit zu einem besseren Verständnis der Phagen- Wirt-Beziehung bei.