Identifizierung und Charakterisierung der Succinsemialdehyd-Dehydrogenase aus parasitischen und nichtparasitischen Arthropoden

Abstract

The objective of the PhD project was the molecular and enzymological characterization of SSADH in parasitic and nonparasitic insects and acarids, organism groups where this enzyme was virtually unexplored. In this project, the list of investigated non-arthropod organisms included the bacterium Escherichia coli (Ec) and the mammal Mus musculus (mouse). Their SSADH served as reference enzymes or were used for biophysical experiments. Amongst the arthropods, Drosophila melanogaster (Dm) (fruit fly) was chosen as nonparasitic model insect. Lucilia cuprina (Lc) (sheep blowfly) and Ctenocephalides felis (Cf) (cat flea) were included as important parasitic insects, as was the acarid Rhipicephalus microplus (Rm) as the economically most important tick species. At the start of this thesis, expressed sequence tag studies and whole genome sequencing on Dm suggested the existence of a single copy gene candidate that, based on amino acid sequence homology, was considered to be a candidate for a SSADH ortholog in this species (DmSSADH). The Dm SSADH gene candidate was cloned and expressed in Ec as a soluble protein. To compare the enzymological properties of DmSSADH, another so far uncharacterized Dm gene candidate for an acetaldehyde dehydrogenase (DmALDH) was cloned and expressed in Ec as a soluble protein. Both expression products showed the expected enzymological properties: a NAD+-dependent ssa-oxidizing activity for DmSSADH and a NAD+-dependent acetaldehyde-oxidizing activity for Dm-ALDH. Site-directed mutageneses on DmSSADH performed in this study demonstrated that two residues essential for catalysis are glutamate 277 and cysteine 311. The second part of the thesis encompassed the gene identification, full length gene cloning of SSADH in Lc (LcSSADH) and Cf (CfSSADH), as well as functional expression of one gene version, respectively. Substrate/cosubstrate specificity determinations combined with enzyme kinetics studies showed that both enzymes are predominantly NAD+-dependent SSADHs. Bioinformatics analyses detected N-terminal mitochondrial import sequences in both Lc and Cf SSADH suggesting that these enzymes are localized in vivo in the mitochondrial matrix. The investigation of the genomic structure of the LcSSADH and CfSSADH genes revealed significant differences to the previously known gene organizations: firstly, different to the single copy SSADH gene situation in Ec, Dm, Mus musculus and Homo sapiens, Lc appears to possess 2-3 SSADH genes, while in Cf up to 8 gene copies may be present. Secondly, compared to Dm (2 exons, 1 intron), the exon/intron structure of the SSADH genes in Lc and Cf is not conserved: the one SSADH genomic gene version investigated in detail in Lc contained 3 exons and 2 introns, while the genomic gene version of Cf analysed in this study was devoid of any introns. The central topic of the third part of this thesis was the gene identification and biochemical characterization of SSADH from the tick Rm. By a combination of different PCR methods a tick gene orthologous to insect and mammalian SSADH (RmSSADH) could be identified and isolated. The results of Southern blot analyses of Rm DNA are incompatible with a single copy situation and suggest the presence of 2-3 RmSSADH genes. To compare RmSSADH with a mammalian SSADH, the respective gene was isolated from mouse. Both the tick and the mouse SSADH genes were then expressed as soluble functional proteins in Ec. The initial comparison showed that both proteins are potent NAD+-dependent ssa-oxidizing enzymes with very similar enzyme kinetics. A more detailed comparison of both enzymes suggests that in general, the mouse enzyme appears to be more specific for succinic semialdehyde than the tick enzyme. In the fourth section of the experimental part of this thesis, saturation transfer difference nuclear magnetic resonance spectroscopy (STD-NMR) experiments were performed on three of the above SSADH preparations, to answer questions on the aldehyde substrate and cosubstrate binding to these enzymes. Importantly, the long-standing question whether the free aldehyde of succinic semialdehyde or its hydrated gem-diol form (present in aqueous solution in equimolar amounts) is the binding substrates was answered conclusively in favour of the aldehyde form for both the Ec and the Dm enzyme. Most remarkably, STD-NMR experimental investigation of the ssa interaction with the Dm SSADH cysteine311alanine mutant enzyme demonstrated binding of both the aldehyde and the gem-diol form. This experiment strongly suggests that cysteine311 is acting as an aldehyde versus gem-diol selectivity filter in the active site of the enzyme. Furthermore, STD-NMR epitope mapping of the NAD+/NADP+ binding to Ec SSADH and Dm SSADH was performed. In both cases, the data suggested that the dominant protein-ligand interactions are via the adenine and the nicotinamide ring systems, while the ribose moieties interact much less intensely with the enzymes.

Ziel dieser Arbeit war es, die in Insektenmodellen weitgehend und in parasitischen Insekten und Akariden vollständig unerforschte SSADH molekularbiologisch und enzymologisch zu charakterisieren. Als Organismen der Wahl dienten das Bakterium Escherichia coli (Ec) und die Maus Mus musculus zu Referenzzwecken und für biophysikalische Untersuchungen des Enzyms, sowie Drosophila melanogaster (Dm) (Fruchtfliege), Lucilia cuprina (Lc) (Schafs-Schmeissfilege), Ctenocephalides felis (Cf) (Katzenfloh), und Rhipicephalus microplus (Rm) (Zecke) als Vertreter verschiedener Organismenklassen. Für Dm lag zunächst durch ?Expressed Sequence Tag?-Studien sowie der Entschlüsselung des Genoms ein Einzelgenkandidat vor, für den Homologiebetrachtungen nahe legten, dass es sich um das Fruchtfliegen-Genortholog für SSADH (DmSSADH) handeln könnte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde dieser Genkandidat kloniert, und in Ec exprimiert. Zur vergleichenden Charakterisierung der enzymatischen Eigenschaften des SSADH-Expressionsprodukts wurde ein Genkandidat für eine Acetaldehyd-Dehydrogenase (DmALDH) aus Dm kloniert und in Ec exprimiert. Beide Produkte zeigten erwartete enzymatischen Eigenschaften: NAD+-abhängige Succinsemialdehyd-oxidierende (DmSSADH) und NAD+-abhängige Acetaldehyd-oxidierende Aktivität (DmALDH). Ein Vergleich der Substrateigenschaften von 30 Aldehyden und z.T. enzymkinetischen Parameter belegte die ausgeprägte Spezifität von DmSSADH für Succinsemialdehyd, während DmALDH als unspezifische Aldehyddehydrogenase eingeordnet wurde. Punktmutagenesestudien zeigten, dass zwei für die SSADH-Aktivität essentielle Aminosäuren Glutamat 277 und Cystein 311 sind. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die Genidentifikation, Volllängen-Genklonierung, sowie die funktionelle Expression jeweils eines Genvertreters von SSADH aus Lc und Cf. Enzymkinetische Studien und Aktivitätsuntersuchungen der E. coli-exprimierten L. cuprina- (LcSSADH) und C. felis- (CfSSADH) Enzyme zeigten, dass beide vor allem NAD+-abhängige SSADHs sind. Analysen der LcSSADH und CfSSADH-Gene mittels PCR-und Southern-Blots zeigten, dass das SSADH-Gen in beiden Organismen nicht als Einzelkopie vorliegt, und dass die Exon-Intron-Struktur von Dm nicht konserviert ist. Die Funktionen der aufgedeckten multiplen Genkopien und die Gründe für die variablen Exon-Intron-Strukturen in den SSADH-Genen der hier betrachteten Spezies bleiben unklar. In Immunblot-Experimenten konnte schließlich gezeigt werden, dass SSADH in Imagines von Dm, Lc und Cf auch auf Proteinebene exprimiert ist. Der dritte Teil der Arbeit hatte die Genidentifizierung, sowie die biochemische Charakterisierung der SSADH aus der Zecke Rm zum Thema. Southern-Blot-Analysen zeigten, dass das SSADH-Gen im Rm-Genom wahrscheinlich in 2-3 Genkopien vorhanden ist. Für einen Vergleich der Zecken-SSADH mit dem Genprodukt eines Mammalier-Orthologen, wurde das SSADH-Gen aus der Maus isoliert und funktionell in Ec exprimiert. Der Vergleich der beiden Enzym ergab, dass beide potente NAD+-abhängige Succinsemialdehyd-oxidierende Aktivität besitzen und sehr ähnliche enzymkinetische Parameter aufweisen. Eine genauere vergleichende Betrachtung der Aktivität gegenüber verschiedenen Aldehydsubstraten zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Enzymen beider Spezies. Generell scheint Maus-SSADH spezifischer für Succinsemialdehyd zu sein als Rm SSADH. Weiterhin ist das Mammalierenzym gegenüber den in dieser Studie identifizierten Inhibitoren p-Tolualdehyd und p-Methoxybenzaldehyd ebenso wie gegenüber Substratinhibition durch einen Überschuss Succinsemialdehyd weit weniger empfindlich als das Zeckenenzym. Es bleibt zu untersuchen, ob diese Unterschiede für die Auffindung potenter und spezifischer Inhibitoren nutzbar sind. Ebenso bleibt die Frage zu beantworten, ob SSADH, bzw. der GABA-Abbau allgemein eine valide akarizide Targetstruktur darstellt. Im vierten Abschnitt der Arbeit wurden drei im Rahmen dieser Arbeit hergestellte SSADH-Enzympräparate in Sättigungstransfer-Differenz-Kernresonanzspektroskopie-(STD-NMR-)Experimente eingesetzt, um Fragen zur Aldehydsubstrat- und Cosubstratbindung an SSADH zu beantworten. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass bei Ec und Dm SSADH das freie Aldehyd dem in wässriger Lösung für Succinsemialdehyd in gleicher Konzentration vorliegende geminale Diol (?gem-Diol?) als Substrat bevorzugt. Die STD-NMR-spektroskopische Untersuchung der Succinsemialdehyd-Interaktion mit der Dm SSADH C311A-Mutante zeigte die Bindung sowohl der Aldehyd- als auch der gem-Diol-Form. Dies deutet darauf hin, dass C311 für die Aldehyd-Selektivität des Enzyms entscheidend ist. Das STD-NMR-Epitopmapping der NAD+/NADP+-Bindung an E. coli-SSADH und an Dm SSADH legte in beiden Fällen die dominanten Protein-Interaktionen der Adenin- und Nikotinamidringe nahe, während die Ribose-Reste vermutlich weit weniger intensiv mit dem Enzym verbunden sind.