Analysis of phytotoxicity and plant growth stimulation by multi-walled carbon nanotubes

Abstract

Nanotechnology is a rapidly expanding area of science and technology, which has gained a great interest due extraordinary properties of nanomaterials with numerous potential fields for practical application. Meanwhile, carbon nanotubes (CNTs) are among the ten most-produced engineered nanomaterials worldwide with applications in automotive industry, building and construction, electronics, and many other industrial sectors, showing also a great potential for integration into environmental and agricultural applications. However, during the last decade it has been demonstrated that nanomaterials can exert significant and extremely variable effects also on living organisms. In higher plants, both, positive and negative responses on growth and development have been reported but the related mechanisms are still not entirely understood. This study presents a systematic assessment of CNT effects on representative crops under standardized conditions with special emphasis on interactions with plant nutrition. After the introductory background (Chapter 1), presenting a comprehensive literature review on carbon nanomaterials with special emphasis on plant responses, environmental and agricultural applications, Chapter 2 describes the impact of selected multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) on seed germination and early seedling development of different crops (soybean−Glycine max, maize−Zea mays, and common bean−Phaseolus vulgaris). In face of highly variable plant responses to CNT treatments reported in the literature, the study was designed as a systematic analysis under standardized growth conditions, dissecting the effects of one single type of MWCNTs, depending on plant species, MWCNT dosage, duration of exposure to MWCNT treatments, and plant-developmental stage, including imbibition, germination and seedling development. Short-term seed treatments (36 h) with MWCNTs reduced the speed of water uptake particularly by soybean seeds, associated with an increased germination percentage and reduced formation of abnormal seedlings. However, during later seedling development, negative effects on fine root production were recorded for all investigated plant species. Inhibition of root growth was associated with reduced metabolic activity of the root tissue and a reduction of nitrate uptake, which could be mainly attributed to the smaller root system. The results demonstrated that even under standardized growth conditions largely excluding external factors, plant responses to MWCNT exposure exhibit differences, depending on plant species but also on the physiological status and the developmental stage of individual plants. Soybean was selected as a model plant for further studies since both, positive and negative effects of the same dose of MWCNTs (1000 mg L-1) could be observed even in the same individual plants. Chapter 3 investigates effects of short-term soybean seed exposure (36 h) to MWCNTs on seedling development, depending on the nutrient availability of the substrate. At 8 DAS stunted growth and poor fine root production were first detectable in seedlings germinating on moist filter paper without additional nutrient supply. This effect was preceded by reduced metabolic activity of the seedling tissues detectable by vital staining already at 2 DAS. Root growth inhibition was a long-lasting effect, detectable in soil culture up to 38 DAS. More detailed investigations revealed zinc (Zn) deficiency as a major growth-limiting factor. The growth of affected soil-grown plants was recovered by foliar application of ZnSO4 or by cultivation in nutrient solution supplied with soluble ZnSO4. A more detailed investigation of the physiological mechanisms related with the inhibitory effects of MWCNTs on plant growth is presented in Chapter 4. Oxidative stress was identified as a major factor determining MWCNT-induced root growth inhibition in soybean, demonstrated by recovery of root development after external supplementation with antioxidants. Induction of oxidative stress by MWCNT application was detectable already after the 36 h imbibition period particularly in the tips of the radicle as indicated by accumulation of superoxide anions, reduced triphenyltetrazolium chloride vital staining, and induction of superoxide dismutase activity. The expression pattern of the oxidative stress indicators coincided with preferential accumulation of MWCNTs in the cells of the root tip and was reverted by external application of proline as antioxidant. MWCNT-induced plant damage could be reverted by external supplementation of micronutrients (Zn, Cu, Mn) as important cofactors for various enzymes involved in oxidative stress defense (SOD, biosynthesis of antioxidative phenolics). Accordingly, SOD activity increased in seedling roots after Zn supplementation. During germination, the CNT treatments inhibited particularly the Zn translocation from the cotyledons to the growing seedling, and CNTs exhibited a selective adsorption potential for Zn and Cu, which may be involved in internal immobilization of micronutrients. Therefore, this study demonstrated for the first time that phytotoxicity of CNTs is linked with disturbances of micronutrient homeostasis during seedling development. Implications for environmental phytotoxicity assessment of MWCNTs and their potential applications in agriculture are discussed in a final overview presented in Chapter 5.

Nanotechnologien repräsentieren ein extrem schnell expandierendes, wissenschaftliches und technologisches Arbeitsfeld, das aufgrund herausragender Eigenschaften und zahlreicher potenzieller, praktischer Anwendungsmöglichkeiten von Nanomaterialien derzeit große Aufmerksamkeit erfährt. Sogenannte „Carbon Nanotubes (CNTs)“ gehören mittlerweile weltweit zu den zehn meistproduzierten Nanomaterialen mit Anwendungen für Verkehrs,- und Transporttechnologien, im Bau-, und Ingenieurswesen, in der Elektrotechnik und vielen anderen Anwendungsbereichen, mit vielversprechenden Möglichkeiten auch in der Umwelttechnik und der Landwirtschaft. Während der vergangen zehn Jahre wurde allerdings deutlich, dass Nanomaterialien signifikante und oft extrem variable Wirkungen auch auf lebende Organismen haben können. Bei höheren Pflanzen wurden sowohl positive als auch negative Effekte auf das Wachstum und die pflanzliche Entwicklung berichtet, und die zugrundeliegenden Mechanismen sind nach wie vor unklar. In der vorliegenden Untersuchung wird eine systematische Bewertung von CNT Wirkungen auf repräsentative Kulturpflanzenarten unter standardisierten Bedingungen vorgestellt, mit besonderem Augenmerk auf mögliche Wechselwirkungen mit der pflanzlichen Ernährung. Nach einem einleitenden Überblick (Kapitel 1), der eine umfassenden Literaturstudie zu Carbon-Nanomaterialien mit Schwerpunkt auf pflanzlichen Wechselwirkungen und Anwendungsperspektiven in der Umwelttechnologie und in der Landwirtschaft vorstellt, beschreibt Kapitel 2 die Wirkungen ausgewählter, so genannter „Multiwalled Carbon Nanotubes (MWCNTs)“ auf die Keimung, und die Keimlingsentwicklung verschiedener Kulturpflanzenarten (Soja – Glycine max, Mais – Zea mays, und Phaseolus-Bohne – Phaseolus vulgaris). Vor dem Hintergrund der extrem heterogenen Wirkungen, die in der Literatur beschrieben werden, wurde eine systematische Analyse unter standardisierten Wachstumsbedingungen in Abhängigkeit der Pflanzenart, der MWCNT-Dosierung, der Dauer der MWCNT-Behandlung, und des pflanzlichen Entwicklungsstadiums durchgeführt. Kurzzeitige Saatgutbehandlungen mit MWCNTs (36 Std.) verminderten die Geschwindigkeit der Wasseraufnahme während der Einquellungsphase besonders bei Soja-Saatgut, was mit einer verbesserten Keimrate und einem verminderten Anteil abnorm entwickelter Keimlinge verbunden war. Während der weiteren Keimlings-entwicklung ergaben sich jedoch negative Wirkungen auf die Feinwurzelbildung bei allen untersuchten Pflanzenarten. Die Wurzelwachstumshemmung ging mit verminderter Stoffwechselaktivität im Wurzelgewebe und verminderter Nitrataufnahme einher, die hauptsächlich auf das schwächer entwickelte Wurzelsystem zurückzuführen war. Die Ergebnisse zeigen, dass selbst unter standardisierten Anzuchtbedingungen, die externe Einflussfaktoren weitestgehend ausschließen, unterschiedliche Wirkungen von MWCNTs in Abhängigkeit von der Pflanzenart, doch auch vom physiologischen Status und dem pflanzlichen Entwicklungsstadium, selbst bei individuellen Pflanzen auftreten können. Soja wurde in diesem Zusammenhang als Modellpflanze für weiterführende Studien ausgewählt, da hier sowohl positive als auch negative Wirkungen bei identischer MWCNT-Dosierung (1000 mg L-1) individuell an derselben Versuchspflanze auftraten. Kapitel 3 untersucht die Wirkungen kurzzeitiger MWCNT-Saatgutexposition (36 Std.) auf die Keimlingsentwicklung von Soja in Abhängigkeit der Nährstoffverfügbarkeit im Anzuchtsubstrat. Bereits acht Tage nach der Aussaat wurde erstmals gehemmtes Pflanzenwachstum und verminderte Feinwurzelentwicklung bei Keimlingen nachweisbar, die auf Keimpapier ohne weiteres Nährstoffangebot wuchsen. Dieser Hemmung ging eine, durch Vitalfärbung nachgewiesene Verminderung der Stoffwechselaktivität, bereits zwei Tage nach Aussaat voraus. Die resultierende Wurzelwachstumshemmung war jedoch ein langfristiger Effekt, der auch noch 38 Tage nach Aussaat bei Pflanzen in Bodenkultur nachweisbar war. Genauere Untersuchungen ergaben, dass Zink-(Zn)-Mangel einer der wichtigsten Wachstumslimitierenden Faktoren war. Das Wachstum von Pflanzen in Bodenkultur konnte durch Blattdüngung mit Zinksulfat regeneriert werden, während Zinksulfat-haltige Nährlösung in hydroponischer Kultur wirksam war. Eine detailiertere Analyse physiologischer Grundlagen der Hemmwirkung von MWCNTs auf das Pflanzenwachstum wird in Kapitel 4 vorgestellt: Oxidativer Stress wurde als Hauptfaktor für die MWCNT-induzierte Wurzelwachstums-hemmung bei Soja identifiziert, was durch die revertierende Wirkung der Supplementierung mit Antioxidantien auf das Wurzelwachstum bestätigt wurde. Die durch MWCNTs ausgelöste oxidative Stressreaktion war bereits innerhalb der 36-stündigen Saatgutquellungsperiode anhand der Akkumulation von Superoxid-Anionen, verminderter Vitalfärbung mit Triphenyltetrazoliumchlorid und erhöhter Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) nachweisbar und erfasste besonders die Keimwurzelspitzen. Das Expressionsmuster dieser oxidativen Stressindikatoren spiegelte die präferentielle Akkumulation von MWCNTs in den Zellen der Wurzelspitze wider und konnte durch externe Applikation von Prolin als Antioxidant revertiert werden. Die MWCNT-induzierten Pflanzenschäden waren ebenso durch die Supplementierung mit Mikronährstoffen (Zn, Cu, Mn) revertierbar, die als wichtige Co-Faktoren für Enzymsysteme der oxidativen Stressabwehr fungieren (SOD, Synthese antioxidativer Phenole). Entsprechend konnte ein Anstieg der SOD Aktivität im Wurzelgewebe MWCNT-behandelter Keimlinge nach Zn Applikation nachgewiesen werden. Die MWCNT-Behandlung hemmte während der Keimung besonders die Zn-Translokation aus den Kotyledonen in die jungen, wachsenden Gewebe des Keimlings und MWCNTs zeigten ein selektives Adsorptionspotenzial besonders für Zn und Cu, das so an einer intrazellulären Immobilisierung dieser Mikronährstoffe beteiligt sein könnte. Damit zeigt die vorliegende Arbeit erstmals, dass die Phytotoxizität von CNTs mit Störungen der Mikronährstoffhomöostase während der Keimlingsentwicklung in Verbindung steht. Die Bedeutung für die Phytotoxizitätsbewertung von MWCNTs und ihrer potenziellen Anwendungen in der landwirtschaftlichen Praxis werden in einer Abschlussbetrachtung diskutiert (Kapitel 5).