Etablierung eines Wirts-induzierten RNAi-Systems für die Kontrolle des Asiatischen Sojabohnenrostes Phakopsora pachyrhizi

Abstract

Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of Asian Soybean Rust is a devastating plant pathogen that can cause significant yield losses in soybean production. So far, Phakopsora pachyrhizi is controlled by the use of fungicides and cultivation practices. A future perspective for the control of obligate biotrophic pathogens such as Phakopsora pachyrhizi, is Host-induced Gene Silencing (HIGS), which utilizes the naturally occuring phenomenon of RNA-interference (RNAi). The basic principle of HIGS is the induction of RNAi targeted against RNA of the fungal pathogen by means of transgenic expression of double stranded RNA (dsRNA) in the host plant. HIGS can be performed by either generating stable transgenic plants or using transient expression systems mainly based on recombinant viral vector systems. Recently, the basic principle of HIGS has been demonstrated in a variety of obligate biotrophic fungal pathogens including the powdery mildew fungus Blumeria graminis or the cereal rusts Puccinia striiformis f. sp. tritici and Puccinia triticina. Furthermore, work on different Fusarium spp. clearly indicates that the use of HIGS can be transferred to pertotrophic pathogens. Althought there is remarkable progress in utilizing HIGS in cereal rusts, to date, no such system has been reported for legume rusts. Thus, the work presented was focused on the development and testing of a HIGS system for the Asian Soybean Rust Phakopsora pachyrhizi. An initial set of ten target genes, presumably essential for signaling, nutrient uptake and host-pathogen interaction, was selected from a database reflecting the haustorial transcriptome of Phakopsora pachyrhizi. Expression of dsRNA complementary to the selected target genes was done using a viral vector system based on the Bean Pod Mottle Virus (BPMV). As an alternative method the use of agroinfiltration for the expression of hairpin RNA (hpRNA) was examined. By using the viral vector system silencing effects were observed for the three target genes Pp_contig01251, Pp_contig05320, and Pp_contig3015. Furthermore, the silencing of Pp_contig05320 resulted in inhibited growth of Phakopsora pachyrhizi as indicated by a reduced number of uredia. The use of agroinfiltration for the expression of hpRNA was not successful. Infiltration of soybean using a syringe resulted in deformation and necrosis of the infiltrated leaf areas. Although the expression of hpRNA could not be realized, the transient transformation of Glycine max via the use of agroinfiltration was demonstrated using a marker gene construct. Concerning the analysis of silencing effects via the use of RT-qPCR, the expression stability of 15 genes from Phakopsora pachyrhizi and 10 genes from Glycine max was analyzed to identify stably expressed reference genes. These studies resulted in the identification of several reference genes, suitable for the normalization of expression data collected under different experimental conditions. The results from this work provide a foundation for further examinations and experiments. Open questions especially concern the factors delimiting a gene as a suitable target gene for HIGS and the molecular mechanism behind the uptake and the translocation of silencing signals in Phakopsora pachyrhizi. Answering these questions will promote the establishment of HIGS as a promising perspective for modern plant protection.

Der Erreger des asiatischen Sojabohnenrostes Phakopsora pachyrhizi ist ein bedeutendes Pathogen für den globalen Sojaanbau und kann innerhalb kürzester Zeit zu erheblichen Ernteausfällen führen. Bislang erfolgt die Bekämpfung von Phakopsora pachyrhizi hauptsächlich durch den Einsatz von Fungiziden und diverse Kulturmaßnahmen. Eine vielversprechende Methode für die zukünftige Kontrolle obligat biotropher Parasiten, wie Phakopsora pachyrhizi, ist die RNA-Interferenz (RNAi) vermittelte Wirts-induzierte Genstilllegung (engl. Host-induced Gene Silencing, HIGS). HIGS basiert auf der transgenen Expression von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in der Wirtspflanze, welche eine RNAi gegen die zu dieser dsRNA komplementären mRNA des Pathogens induziert. Die Expression von dsRNA kann dabei entweder durch die stabile Transformation der Wirtspflanze mit dsRNA-Konstrukten, oder durch transiente Expressionssysteme erreicht werden. In jüngerer Vergangenheit wurde HIGS in verschiedenen obligat biotrophen Parasiten, wie dem Getreidemehltau Blumeria graminis oder den Getreiderosten Puccinia striiformis f. sp. tritici und Puccinia triticina, demonstriert. Darüber hinaus sprechen Arbeiten an verschiedenen Fusarium spp. dafür, dass HIGS auch auf nektrotrophe Parasiten übertragbar ist. Obwohl es bei den Getreiderosten beachtliche Fortschritte bei der Entwicklung von HIGS gegeben hat, steht bislang kein vergleichbares System für die Verwendung bei Leguminosenrosten zur Verfügung. Aufgrund der immensen ökonomischen Bedeutung von Phakopsora pachyrhizi, bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Etablierung eines HIGS-Systems, für die Verwendung im obligat biotrophen Pathosystem Phakopsora pachyrhizi vs. Glycine max. Als Zielgene wurden dafür zehn Gene mit wichtigen Funktionen in essentiellen Signal- und Stoffwechselwegen aus einer haustoriellen Transkriptomdatenbank von Phakopsora pachyrhizi ausgewählt. Die Expression von dsRNA erfolgte mittels eines auf dem Bean Pod Mottle Virus (BPMV) basierenden, viralen Vektorsystems. Die Inokulation von Glycine max mit rekombinanten Viren erfolgte sowohl biolistisch, als auch über mechanische Verfahren. Die Expression rekombinanter Viren, induzierte für die drei Zielgene Pp_contig01251, Pp_contig05320 und Pp_contig3015 eine partielle Genstilllegung, welche in Form einer reduzierten relativen Transkripthäufigkeit beobachtet werden konnte. Für Pp_contig05320 war zudem ein negativer Einfluss auf das Wachstum von Phakopsora pachyrhizi erkennbar. Als eine alternative Methode für die Expression von doppelsträngiger Haarnadel-RNA (engl. hairpin RNA, hpRNA) in Glycine max wurde die Agroinfiltration getestet. Da diese Methode jedoch zu einer starken Schädigung des infiltrierten Blattgewebes führte, konnte die Agroinfiltration im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen nicht etabliert werden. Allerdings gelang es, die erfolgreiche transiente Transformation von Glycine max mittels Agroinfiltration über die Expression eines Markergenkonstruktes nachzuweisen und damit die prinzipielle Eignung dieser Methode für die transiente Transformation von Glycine max zu belegen. Aufgrund der Verwendung der RT-qPCR für die Quantifizierung der relativen Transkripthäufigkeit, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Gene von Phakopsora pachyrhizi und Glycine max auf ihre Eignung als Referenzgene für die Normalisierung untersucht. Durch die Verwendung der Algorithmen geNorm und NormFinder gelang es, stabil exprimierte Referenzgene aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Phakopsora pachyrhizi zu identifizieren. Zudem wurde die stabile Expression verschiedener Referenzgene von Glycine max im zeitlichen Verlauf einer Infektion mit Phakopsora pachyrhizi analysiert und stabil exprimierte Referenzgene identifiziert. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass das Prinzip der Wirts-induzierten Genstilllegung auch auf Phakopsora pachyrhizi übertragbar ist. Darüber hinaus ermöglicht die Identifizierung stabil exprimierter Referenzgene die Erhebung valider Expressionsdaten in zukünftigen Arbeiten. Offene Fragen bestehen insbesondere hinsichtlich der Faktoren, welche die Eignung eines Gens als Zielgen für HIGS definieren und den molekularen Mechanismen, die an der Aufnahme und Verbreitung von Silencing-Signalen in Phakopsora pachyrhizi beteiligt sind. Die Beantwortung dieser Fragen in weiterführenden Arbeiten wird dazu beitragen, HIGS als eine Perspektive für den modernen Pflanzenschutz zu etablieren.