Establishment of the body axes in Xenopus laevis through goosecoid, myosin 1d and bicaudal c

Abstract

The bilaterian body plan consists of three body axes: the anteroposterior (AP; head-trunk/tail), the dorsoventral (DV; back-belly) and the left-right (LR; placement of inner organs) axis. Axis formation occurs during early embryogenesis and is critical for further development and viability of the embryo. In this comprehensive study three highly conserved determinants were functionally analyzed in the context of axis development. The first chapter of this work covers the autoregulatory, homeodomain containing, repressor gene goosecoid (gsc), whose most prominent expression marks the Spemann-(Mangold) organizer (SO). The SO is the primary dorsal signaling center and is instructive for tissue patterning along the DV and AP axes. Transplanting the SO or misexpressing gsc on the opposite ventral side of an embryo is sufficient to establish a new/secondary AP axis. However, its function during normal development in the SO remained enigmatic as the gsc loss of function (LOF) lead to no severe early developmental defects. To elucidate the function of gsc, timed gain of function (GOF) experiments were performed. Gsc efficiently repressed the planar cell polarity (PCP)/Wnt signaling pathway leading to severe gastrulation and neurulation defects. This novel Gsc function was correlated with two vertebrate specific domains, suggesting an evolutionary new function of Gsc with the emergence of jaws/neural crests in vertebrates. The second chapter of this study addresses the functions of Myosin1d (Myo1d) and Bicaudal c1 (Bicc1) during the LR axis determination in vertebrates. In this group LR symmetry breakage takes place at a ciliated epithelium called LR organizer (LRO). The initial cue for the asymmetric LR axis development is a cilia-driven leftward fluid flow. These cilia have to be correctly polarized through PCP/Wnt signaling. Interestingly, the invertebrate Drosophila melanogaster also displays a distinct LR axis but uses a cilia independent, yet not fully understood, mechanism. It depends on a myo1d homologous gene, myo31DF, and PCP. To unravel a potential common evolutionary origin of the bilaterian LR axis myo1d was analyzed during Xenopus laevis lateralization. Myo1d LOF experiments disturbed LR axis formation by compromising PCP dependent outgrowth and polarization of LRO cilia. These experiments link the PCP/Myosin based mechanism of flies to the newly evolved cilia/flow dependent mode of vertebrate LR axis determination suggesting actomyosin as common ancestral LR determinant. Contrary to Myo1d, Bicc1 was already described for its function during polarization of flow producing LRO cilia. However bicc1s expression is most prominent in the sensory LRO cells (sLRO). These cells detect the fluid flow and translate it into left-sided signaling of the morphogen Nodal1 and consequently asymmetric LR axis formation. These cells downregulate the expression of the secreted Nodal1 antagonist DAN domain family member 5 (dand5) in response to flow. Bicc1s function was re-evaluated with respect to its function in sLRO cells. Ex vivo and in vivo experiments involving GOF as well as LOF experiments showed that Bicc1 regulates both dand5 and nodal1 via a direct and indirect post-transcriptional mechanism, respectively. In the process of dand5 regulation several other LR determinants and regulatory events were linked with the Bicc1 dependent mechanism: Dicer1 dependent microRNA repression of dand5 and a proposed cation channel Polycystin 2 mediated Bicc1 modification. These results highlight the importance of a tightly controlled Dand5 protein level as decisive for the overall outcome of the LR symmetry breakage in vertebrates.

Der Körperbauplan von Bilateria setzt sich aus drei Körperachsen zusammen: Der anteroposterioren (AP; Längsachse), der dorsoventralen (DV; Rücken-Bauch) und der links-rechts (LR, Anordnung der inneren Organe) Achse. Die Körperachsenbildung findet während der frühen Embryonalentwicklung statt und ist entscheidend für die weitere Entwicklung und die Lebensfähigkeit des Embryos. In dieser umfassenden Arbeit wurden drei hoch konservierte Determinanten auf ihre Funktion während der Achsenentwicklung analysiert. Das erste Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Funktion des autoregulatorischen Repressors und Homeoboxgens goosecoid (gsc), dessen bekannteste Expression den Spemann-(Mangold) Organisator (SO) markiert. Der SO ist das primäre dorsale Signalzentrum und bekannt für seine instruktive gewebespezifizierende Funktion entlang der AP- und der DV-Achse. Transplantation des SO oder Missexpression von gsc auf der gegenüberliegenden, ventralen, Seite des Embryos, ist ausreichend, um eine neue/zweite AP Körperachse zu erzeugen. Trotzdem blieb seine Funktion im SO während der normalen Entwicklung rätselhaft, da ein Funktionsverlust zu keinen massiven frühen Entwicklungsproblemen führte. Um die Funktion von gsc herauszufinden wurden zeitlich und räumlich terminierte Überexpressionen durchgeführt. Gsc reprimierte effizient den Planaren Zellpolaritäts (PCP)/Wnt Signalweg was zu ernsthaften Gastrulations- und Neurulationsdefekten führte. Die neu beschriebene Funktion von Gsc konnte mit zwei Wirbeltier-spezifischen Domänen korreliert werden. Dies suggerierte eine evolutionär neue Funktion von Gsc mit der Entstehung von Kiefern und Neuralleistenzellen in Wirbeltieren. Das zweite Kapitel dieser Arbeit behandelt die Funktion von Myosin1d (Myo1d) und Bicaudal c1 (Bicc1) während der LR Achsenentwicklung in Wirbeltieren. In dieser Tiergruppe wird die LR Symmetrie durch ein ciliertes Epithel, den sogenannten LR Organisator (LRO), gebrochen. Das erste Signal für die asymmetrische LR Entwicklung ist ein durch Cilien erzeugter linksgerichteter Flüssigkeitsstrom. Dafür müssen diese Cilien durch den PCP Signalweg korrekt polarisiert sein. Interessanterweise zeigt das wirbellose Tier Drosophila melanogaster auch eine eindeutige LR-Achse, für die sie allerdings einen Zilien-unabhängigen Mechanismus verwenden. Dieser ist bis heute noch nicht eindeutig geklärt, beruht aber auf dem myo1d orthologen Gen myo31DF und dem PCP Signalweg. Um einen potentiellen evolutionären Ursprung der LR Achsenentwicklung in Bilateria zu entschlüsseln, wurde myo1d während der Lateralisierung in Xenopus laevis analysiert. Funktionsverlust Experimente von Myo1d resultierten dabei in einer gestörten LR Achsenentwicklung, basierend auf einer Störung des PCP abhängigen Auswachsens und der Polarisierung der LRO-Cilien. Diese Experimente verbinden den PCP/Myosin abhängigen Mechanismus von Fliegen mit dem neu evolvierten Cilien/Flüssigkeitsstrom abhängigen Mechanismus der LR Achsenentwicklung in Wirbeltieren. Somit wird ein Actomyosin abhängiger Mechanismus als gemeinsamer ursprünglicher LR Achsendeterminant für Bilateria impliziert. Im Gegensatz zu Myo1d wurde für Bicc1 schon eine Funktion während der Polarisierung der LRO Cilien beschrieben. Dennoch ist die markanteste Expression von bicc1 in den sensorischen LRO Zellen (sLRO), welche den Flüssigkeitsstrom detektieren und in ein linksseitiges Signal des Morphogens Nodal1 umwandeln. Dieses Signal resultiert dann in der Entstehung der asymmetrischen LR Achse. Als Antwort auf den Flüssigkeitsstrom wird die Expression von dem sekretierten Nodal1-Antagonisten DAN domain family member 5 (dand5) in den sLRO Zellen runter reguliert. Die Funktion von Bicc1 sollte im Bezug auf die Funktion in den sLRO Zellen reevaluiert werden. Ex vivo und in vivo Funktionsverlust und Funktionsgewinn Experimente zeigten, dass Bicc1 sowohl dand5 direkt als auch nodal1 indirekt post-transkriptional reguliert. Desweiteren wurden auch andere LR Determinanten mit dem Mechanismus der Bicc1 abhängigen dand5 Regulation vernetzt: Die Dicer1 abhängige microRNA vermittelte Repression von dand5 und die mögliche Modifikation von Bicc1 in Abhängigkeit vom Kationen-Kanal Polycystin 2 (Pkd2). Diese Ergebnisse verdeutlichen maßgeblich die Bedeutung eines engmaschig kontrollierten Dand5 Proteinlevels für das Ergebnis des LR Symmetriebruchs in Wirbeltieren.