Development of a planar yeast estrogen screen as screening tool for estrogen active compounds

Abstract

Substances that disrupt or impair the hormone system (endocrine system) or that show an irreversible influence on it are referred to as endocrine disruptors or xenohormones. Concerning this, also estrogen active compounds (EAC) are endocrine disruptors, that are under suspicion of being involved in the formation of tumors or to induce disruption during development and reproduction, and are, for example, blamed for being responsible for the feminization of fish. At this, EAC can be natural (human, phytoestrogens) but also synthetic substances, which are discharged to the environment by humans (e.g. pharmaceuticals, pesticides, additives). Regarding the ubiquitous presence of EAC, suitable methods for the analysis of EAC are required. An in vitro method for the determination of EAC is the YES assay (yeast estrogen screen) that is executed in liquid solutions in microtiter plates and that works with genetically modified yeasts, which contain the human estrogen receptor (hER) and a reporter gene encoding for the enzyme beta-galactosidase. In presence of EAC, the enzyme is produced and subsequently cleaves a substrate that is used to measure the receptor activity and thus the estrogenic activity. The transfer of the YES assay to high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) was successfully demonstrated and advanced, thus resulting in the combination of a chromatographic separation of analytes and the detection of EAC using genetically modified yeast cells directly on the HPTLC plate (HPTLC planar yeast estrogen screen, HPTLC-pYES). Usually, the substrate 4-methylumbelliferyl-beta-D-galactopyranoside is used for pYES, releasing blue fluorescing 4-methylumbelliferone (MU) after enzymatic cleavage. Various matrices, however, often contain a plenty of different components, partly showing native fluorescences (blue, red), why the detection of the blue fluorescing MU can be interfered. By applying the substrate resorufin-beta-D-galactopyranoside (RGP) and by using automated devices, the RGP-pYES as fast screening tool for EAC was developed and successfully applied to waste water samples and extracts of hops pellet samples. A screening method using HPTLC simultaneously represents a planar clean-up, why samples do not have to undergo complex steps of sample preparation or purification. The chromatographic separation in combination with the detection of estrogenic activity using genetically modified yeasts directly on the plate allowed the detection, the determination and the identification of single EAC. Using RGP, which releases orange fluorescing resorufin after enzymatic cleavage as positive signal of estrogenic activity, enabled a clear differentiation between fluorescences due to estrogenicity and the native fluorescence of sample components. Application of the RGP-pYES to spiked water samples and sewage samples showed high recovery rates and a good precision, and thus the applicability of the method as screening tool for environmental samples. By means of suitable evaluation methods, additionally the generation of dose-response curves of known and unknown EAC and thus the generation of so-called logit-log plots was possible. This enabled the determination of estradiol equivalent factors of known EAC as well as the determination of estradiol equivalent concentrations and amounts, respectively, of known and unknown EAC in liquid and solid samples. Thus, the possibility to estimate the estrogenic potential of a sample or single sample components was given. The coupling of pYES to mass spectrometry additionally allowed the identification of unknown EAC, demonstrated exemplarily by investigation of extracts of hops pellet samples, in which the only detected EAC in the hops extracts was identified as prenylnaringenin. Since the method uses a planar system, the pYES advantageously reveals all chromatographically separated sample components at one look and, as bioassay, additionally detects a possible estrogenic activity (activity at the hER) of single substances, while a differentiation between native occurring fluorescences of sample contaminants and the fluorescence as positive signal for estrogenicity of a substance is granted.

Stoffe, welche das Hormonsystem (endokrine System) irreversibel beeinflussen, stören oder beeinträchtigen, werden als endokrine Disruptoren oder auch als Xenohormone bezeichnet. Hierzu zählen ebenso estrogen wirksame Substanzen (estrogen active compounds, EAC), welche unter anderem im Verdacht stehen bei der Tumorbildung beteiligt zu sein oder Störungen in der Entwicklung und Reproduktion hervorzurufen, und beispielsweise für die Verweiblichung von Fischen verantwortlich zu sein. EAC können hierbei natürlichen Ursprungs (menschlich, pflanzlich) sein oder synthetisch hergestellte Stoffe, welche durch den Menschen in die Umwelt eingetragen werden (z.B. Arzneimittel, Pestizide, Additive). Aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens sind geeignete Methoden zur Untersuchung auf EAC erforderlich. Eine in vitro Methode zur Bestimmung von EAC ist der YES-Assay (yeast estrogen screen), welcher in flüssigen Medien in Mikrotiterplatten durchgeführt wird und mit genetisch modifizierten Hefen arbeitet, die den humanen Estrogenrezeptor (human estrogen receptor, hER) und ein Reportergen enthalten, welches für das Enzym beta-Galactosidase kodiert. In Anwesenheit von EAC wird das Enzym produziert und setzt anschließend ein Substrat um, welches zur Messung der Rezeptor- und damit der Estrogenaktivität dient. Die Übertragung des YES-Assay auf die Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (high-performance thin-layer chromatography, HPTLC) wurde erfolgreich gezeigt und weiterentwickelt, so dass eine chromatographische Trennung der Analyten mit dem Nachweis einer möglichen estrogenen Aktivität unter Verwendung genmodifizierter Hefezellen direkt auf der HPTLC-Platte kombiniert werden konnte (HPTLC planar yeast estrogen screen, HPTLC-pYES). Für gewöhnlich wird das Substrat 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Galactopyranosid für den pYES eingesetzt, welches nach enzymatischer Spaltung blau fluoreszierendes 4-Methylumbelliferon (MU) freisetzt. Häufig beinhalten unterschiedliche Matrices jedoch viele verschiedene Begleitkomponenten, welche teilweise native Fluoreszenzen aufzeigen (blau, rot), wodurch der Nachweis des blau fluoreszierenden MU gestört werden kann. Durch die Wahl des Substrates Resorufin-beta-D-Galactopyranosid (RGP) und unter Verwendung automatisierter Geräte wurde der RGP-pYES als schnelles Screening auf EAC entwickelt und erfolgreich auf Abwasserproben und Extrakte von Hopfenpellets angewandt. Ein Screening unter Einsatz der HPTLC stellt gleichzeitig ein planares Clean-up dar, wodurch die Proben keinen aufwändigen Reinigungs- oder Aufarbeitungsschritten unterzogen werden müssen. Die chromatographische Trennung in Kombination mit dem Nachweis estrogener Aktivität mittels genmodifizierter Hefen direkt auf den Platten ermöglichte den Nachweis, die Bestimmung und die Identifizierung einzelner EAC. Die Verwendung des RGP, welches durch enzymatische Spaltung orange fluoreszierendes Resorufin als positiven Nachweis estrogener Aktivität freisetzt, erlaubte hierbei eine klare Differenzierung von Fluoreszenzen aufgrund estrogener Wirksamkeit gegenüber der nativen Fluoreszenz von Probenkomponenten. Die Anwendung des RGP-pYES auf Extrakte gespikter Wasserproben und Abwasserproben zeigte hohe Wiederfindungsraten und eine gute Präzision und damit die Eignung der Methode als Screening-Tool für Umweltproben. Mittels geeigneter Auswerteverfahren war es zudem möglich, Dosis-Wirkungs-Kurven bekannter und unbekannter EAC und daraus sogenannte logit-log Plots zu erstellen. Hiermit war die Bestimmung von Estradiol-Äquivalenz-Faktoren bekannter EAC sowie die Ermittlung von Estradiol-Äquivalenz-Konzentrationen bzw. -Gehalten bekannter und unbekannter EAC in flüssigen und festen Proben möglich. Damit war die Möglichkeit der Abschätzung des estrogenen Potentials einer Probe oder einzelner Probenkomponenten gegeben. Die Kopplung des pYES mit der Massenspektrometrie erlaubte zusätzlich die Identifizierung unbekannter EAC, wie am Beispiel der Untersuchung von Extrakten von Hopfenpellets gezeigt werden konnte, in welchen Prenylnaringenin als einzig nachweisbare EAC der Hopfenextrakte identifiziert wurde. Als Methode im planaren System bietet der pYES den Vorteil, alle chromatographisch getrennten Probenbestandteile auf einen Blick zu sehen und zusätzlich als Bioassay eine mögliche estrogene Aktivität (Aktivität am hER) einzelner Substanzen nachzuweisen, während zwischen nativ auftretenden Fluoreszenzen von Probenkomponenten und der Fluoreszenz als Positivsignal der Estrogenaktivität einer Substanz differenziert werden kann.