Evaluation of fresh and preserved sheep faeces as an inoculum source in in vitro gas production assays

Abstract

In order to meet the animals’ requirements of energy and nutrients, knowledge of the feed value of individual feed components is essential. In this context, information on ruminal degradability of feeds is crucial for formulating rations for ruminants. Information of this kind can be obtained using in vitro methods, such as the Hohenheim gas test (HGT). This method allows for the estimation of the organic matter digestibility and the energy value, as well as the protein value of ruminant feeds when applying the extended HGT (eHGT). In vitro methods provide a cost-efficient, rapid, and standardisable alternative to in situ and in vivo approaches, while contributing to reducing animal burden and the number of experimental animals. However, the HGT currently depends on using rumen fluid, which is commonly obtained from rumen-cannulated animals. Due to ethical concerns related to animal welfare and practical considerations, there is growing interest in replacing rumen-cannulated animals for the in vitro feed evaluation in the HGT and eHGT systems. However, the use of individual enzymes or enzyme mixtures for in vitro evaluation of feeds has not yet proven suitable for adequately representing the complex microbial activity of a rumen fluid inoculum (RI). In contrast, several findings in the literature indicate the potential of faeces as an alternative inoculum source to rumen fluid. However, to date, this approach has not been established in the routine analysis of ruminant feeds. The overarching aim of the present thesis was to systematically evaluate the suitability of sheep faeces as an alternative inoculum source to rumen fluid in the HGT. To this end, in vitro gas production (GP) was compared between faecal inoculum (FI) and RI. Additionally, the potential of using preserved faeces as an alternative inoculum source to fresh faeces, as well as the application of FI in the eHGT system, was evaluated. To compare faeces and rumen fluid as inoculum sources in the HGT and eHGT, RI was prepared according to the standard procedure using rumen fluid obtained from two rumen-cannulated lactating dairy cows and FI was prepared from rectally collected faeces of three adult wether sheep. The objective of Manuscript 1 was to examine whether FI and RI generally follow similar GP kinetics and to assess whether feed-specific variation could be observed. Furthermore, there was considerable interest in determining whether FI-GP and RI-GP are related to each other, as this could provide the basis for the future applicability of FI. A total of 90 currently relevant ruminant feeds from various categories and differing nutrient compositions were incubated in vitro with both FI and RI for 72 h, with multiple readings in the HGT. By using FI, lower GP kinetics were observed across all feed categories compared to RI. On average of all feeds, the potential GP was 9 mL/200 mg dry matter (DM) lower and the GP rate was 3.1%/h lower with FI than RI. Additionally, a lag phase of 1.51 h was estimated with FI, whereas no lag phase was observed for RI. The results indicate an overall lower fermentation activity of FI compared to RI. Despite these differences, the GP kinetic curves of the two inocula exhibited a very similar progression. Moreover, strong linear relationships were found between RI-GP at 24 h, the common incubation time of RI in the HGT, and FI-GP at both 24 h (Slope = 1.02, R² = 0.97) and 48 h (Slope = 1.1, R² = 0.97). Additionally, within the scope of this thesis, linear regression analyses were conducted based on a combined dataset from Manuscript 1 and previous studies. By using data from more than 400 different feeds in these analyses, the strong linear relationships between RI-GP at 24 h and FI-GP at 24 h (Slope = 0.98, R² = 0.93) as well as 48 h (Slope = 1.02, R² = 0.96) were confirmed. Dividing the dataset into the feed categories roughages and concentrates for the calculation of separate regression equations did not provide a clear advantage over using a single equation for all feeds. Despite the lower GP observed with FI, a consistent relationship was evident between the GP of both inocula across the different feeds, enabling a reliable estimation of RI-GP from FI-GP in the HGT. The use of preserved instead of fresh faeces would allow for a centralised housing of donor sheep, thereby reducing the number of animals required and improving standardisation. The aim of Manuscript 2 was to investigate the effect of differently preserved sheep faeces on the in vitro GP of nine different feeds and the microbiome in the HGT, intending to maintain a high level of microbial activity during incubations. Seven different freezing and freeze-drying treatments were applied. On average across all feeds, the potential GP of the frozen treatments (61 mL/200 mg DM) was comparable to that of the fresh faeces (62 mL/200 mg DM), whereas the freeze-dried treatments accounted for only 71-85% of the fresh faecal value. The results were confirmed by metaproteome analyses, as the microbiomes of the fresh and frozen treatments were significantly different from that of the freeze-dried treatments based on the relative abundance of the core proteins (p < 0.001). This demonstrated that stress factors associated with the freeze-drying process significantly impaired the microbiome, consequently affecting fermentation activity and GP. By contrast, the freezing process appeared more gentle on the microbiome, preserving a high microbial activity. Furthermore, strong relationships were found between RI-GP at 24 h and GP of the frozen treatments at 48 h of incubation (Slope = 1.27, R² = 0.96). Additionally, the effect of storage on freeze-dried and frozen treatments was investigated, revealing a considerable negative impact on GP and its relationship with RI-GP for both treatments. This limits the high potential for estimating RI-GP, which was particularly demonstrated with frozen faeces, and therefore requires further research. Manuscript 3 aimed to investigate the potential suitability of FI in the eHGT for estimating the protein value of ruminant feeds. The eHGT is used to estimate ruminally undegradable crude protein (RUP) and microbial crude protein. Ammonia-nitrogen (NH3-N) is a key parameter in this context, as it is released during microbial crude protein degradation and provides a nitrogen source for the microbes. FI and RI were therefore compared based on NH3-N and calculated microbially bound nitrogen (mN) following in vitro incubation of six different feeds for 8, 24, and 48 h. The NH3 N content was 17 and 23% lower with FI than with RI after 24 and 48 h, respectively. With RI, mN values decreased over the incubation time for most feeds, whereas with FI, mN initially increased before declining at later incubation times. This suggests that crude protein degradation and microbial binding of nitrogen occur more slowly and to a lesser extent with FI. However, both inocula demonstrated a comparable response to an additional energy source and showed strong linear relationships for NH3-N, particularly after 24 h (Slope = 1.39, R² = 0.98), indicating similar microbial mechanisms in faeces and rumen fluid. The RUP was also estimated for both inocula in this thesis, and the results showed an inconsistent ratio between FI and RI incubations across the six feeds. Similarly, an inconsistent ratio between the two inocula was observed for the mN data. Therefore, further studies involving a larger number of feeds, as well as the testing of mathematical approaches, are necessary to better evaluate the suitability of FI for estimating the protein value of ruminant feeds with the eHGT. In conclusion, the use of sheep faeces as an inoculum source for the in vitro analysis of ruminant feeds can be considered suitable for replacing rumen fluid and thus rumen-cannulated animals in the HGT. By reliably predicting the RI-GP from FI-GP, the predicted RI-GP can be used in the official and validated equations to estimate organic matter digestibility and metabolisable energy of ruminant feeds. The methodological approach applied in this thesis, including sheep feeding, faeces collection, and inoculum preparation, appeared appropriate in achieving a high and consistent microbial activity in the FI. Furthermore, a high potential was demonstrated for using preserved, particularly frozen, sheep faeces for application in the HGT, as well as the use of FI for estimating the protein value of feeds in the eHGT. However, further investigations are required for the two application fields to assess the suitability of FI comprehensively.

Um eine bedarfsgerechte Versorgung von Tieren mit Energie und Nährstoffen zu gewährleisten, ist die Kenntnis des Futterwerts der einzelnen Futterkomponenten essenziell. Für die Formulierung von Rationen für Wiederkäuer sind in diesem Zusammenhang Informationen zur Abbaubarkeit von Futtermitteln im Pansen von entscheidender Bedeutung. Einen wichtigen Beitrag dazu können in vitro Verfahren wie der Hohenheimer Futterwerttest (HFT) leisten. Hierdurch kann die Schätzung der Verdaulichkeit der Organischen Masse und des energetischen Wertes sowie im erweiterten HFT (eHFT) die Schätzung des Proteinwertes von Futtermitteln für Wiederkäuer erfolgen. In vitro Verfahren bieten eine vergleichsweise kostengünstige, schnelle und gut standardisierbare Alternative zu in situ oder in vivo Verfahren und können gleichzeitig zur Reduktion der Tierbelastung und der Anzahl von Versuchstieren beitragen. Der HFT basiert derzeit jedoch auf der Verwendung von Pansenflüssigkeit, welche üblicherweise von pansenfistulierten Tieren gewonnen wird. Aus ethischen Gründen in Bezug auf das Wohlergehen der Tiere und praktischen Erwägungen besteht ein großes Bestreben darin, pansenfistulierte Spendertiere für die in vitro Untersuchung von Futtermitteln im HFT und eHFT zu ersetzen. Ein dahingehender Einsatz einzelner Enzyme oder Enzymmischungen, für die in vitro-Bewertung von Futtermitteln, kann jedoch gegenwärtig nicht adäquat die komplexe mikrobielle Aktivität des Pansenflüssigkeits-Inokulums (RI) abbilden. Dahingegen weisen einige Ergebnisse in der Literatur auf das Potential von Kot als alternative Inokulumquelle zu Pansenflüssigkeit hin, jedoch fand dieser Ansatz bislang keine Anwendung in der Routineuntersuchung von Futtermitteln für Wiederkäuer. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, die Eignung von Schafkot als alternative Inokulumquelle zu Pansenflüssigkeit im HFT systematisch zu evaluieren, um dessen Anwendbarkeit zu forcieren. Hierzu wurde die in vitro Gasbildung (GB) zwischen Kot-Inokulum (FI) und RI verglichen. Zudem wurde das Potential der Verwendung von konserviertem Kot als alternative Inokulumquelle zu frischem Kot sowie die Anwendung von FI im eHFT geprüft. Um Kot und Pansenflüssigkeit als Inokulumquellen im HFT und eHFT zu vergleichen, wurde das RI gemäß der Standardmethoden unter Verwendung von Pansenflüssigkeit zweier pansenfistulierter Milchkühe hergestellt, während für die Herstellung des FI rektal gewonnener Kot von drei ausgewachsenen Hammeln verwendet wurde. Das Ziel von Manuskript 1 bestand darin, zu prüfen, ob FI und RI grundsätzlich einer ähnlichen GB-Kinetik folgen und ob hierbei futtermittelspezifische Unterschiede vorliegen. Zudem bestand ein großes Interesse an der Frage, ob zwischen der FI-GB und RI-GB ein Zusammenhang besteht, was die Grundlage für die künftige Anwendbarkeit von FI darstellen könnte. Dazu wurden 90 aktuell relevante Futtermittel für Wiederkäuer aus verschiedenen Kategorien und unterschiedlicher Nährstoffzusammensetzung jeweils mit FI und RI für insgesamt 72 h mit mehreren Ablesezeiten in vitro im HFT inkubiert. Dabei zeigte sich mit FI für alle Futtermittelkategorien eine niedrigere GB-Kinetik als mit RI. Im Durchschnitt aller Futtermittel lag die potentielle GB von FI um 9 mL/200 mg Trockenmasse (TM) unterhalb der von RI und wies eine um 3.1 %/h niedrigere GB-Rate als RI auf. Zudem wurde für FI eine anfängliche Verzögerungszeit von 1.51 h geschätzt, die für RI nicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse deuten auf eine insgesamt geringere Fermentationsaktivität von FI im Vergleich zu RI hin. Trotz dieser Unterschiede zeigten die GB-Kinetikkurven der beiden Inokula einen sehr ähnlichen Verlauf. Außerdem wurden starke lineare Zusammenhänge zwischen RI-GB nach 24 h, der üblichen Inkubationszeit mit RI im HFT, und FI-GB nach 24 h (Steigung = 1.02, R² = 0.97) sowie nach 48 h (Steigung = 1.1, R² = 0.97) beobachtet. Ergänzend wurden im Rahmen dieser Arbeit lineare Regressionsanalysen auf Basis eines zusammengeführten Datensatzes aus Manuskript 1 und früheren Untersuchungen durchgeführt. Unter Einbezug von über 400 verschiedenen Futtermitteln bestätigten sich dabei die starken lineare Zusammenhänge zwischen der RI-GB nach 24 h und der FI-GB nach 24 h (Steigung = 0.98, R² = 0.93) sowie nach 48 h (Steigung = 1.02, R² = 0.96). Eine Aufteilung des Datensatzes in die Kategorien Grobfuttermittel und Konzentratfuttermittel zur Berechnung separater Regressionsgleichungen zeigte insgesamt keinen deutlichen Vorteil gegenüber einer Gesamtgleichung für alle Futtermittel. Trotz der niedrigeren FI-GB bestand demnach über die verschiedenen Futtermittel hinweg ein konstantes Verhältnis zwischen der GB der beiden Inokula, welches eine zuverlässige Schätzung der RI-GP aus FI-GP im HFT ermöglicht. Die Verwendung von konserviertem anstelle von frischem Kot würde eine zentralisierte Haltung der Spenderschafe ermöglichen, wodurch sich die Anzahl der hierfür eingesetzten Tiere reduzieren und die Standardisierbarkeit verbessern ließe. Das Ziel von Manuskript 2 bestand deshalb darin, den Einfluss von unterschiedlich konserviertem Kot auf die in vitro GB von neun verschiedenen Futtermitteln sowie auf das Mikrobiom im HFT zu untersuchen. Dabei wurde der Erhalt einer hohen mikrobiellen Aktivität angestrebt. Hierfür wurden sieben verschiedene Gefrier- und Gefriertrocknungsbehandlungen durchgeführt. Im Durchschnitt aller Futtermittel war die potentielle GB der gefrorenen Behandlungen (61 mL/200 mg TM) vergleichbar mit derjenigen des frischen Kots (62 mL/200 mg TM), während die gefriergetrockneten Behandlungen lediglich 71-85% des Frischkotwertes erreichten. Die Ergebnisse der GB wurden durch Metaproteomanalysen gestützt, da sich das Mikrobiom der frischen und gefrorenen Behandlungen, basierend auf der relativen Häufigkeit der Coreproteine, signifikant von dem der gefriergetrockneten Behandlungen unterschied (p < 0.001). Dies verdeutlicht, dass die mit dem Gefriertrocknungsprozesses verbundenen Stressfaktoren das Mikrobiom und in der Folge die Fermentationsaktivität und GB deutlich beeinträchtigen. Der Gefrierprozess schien hingegen schonender für das Mikrobiom gewesen zu sein und eine hohe mikrobielle Aktivität bewahrt zu haben. Darüber hinaus konnten in dieser Arbeit starke lineare Zusammenhänge zwischen RI-GB nach 24 h und der GB der gefrorenen Kotbehandlung nach 48 h Inkubation (Steigung = 1.27, R² = 0.96) festgestellt werden. Weiterhin wurde auch der Einfluss einer Lagerung der gefriergetrockneten und gefrorenen Behandlungen geprüft, welche sich bei beiden Behandlungen deutlich negativ auf die GB und die Beziehung zu RI-GB auswirkte. Dies begrenzt das hohe Potential zur Schätzung der RI-GB, welches insbesondere für gefrorenen Kot gezeigte wurde, und erfordert daher zusätzliche Forschungsarbeit. Manuskript 3 verfolgte das Ziel, FI hinsichtlich der potentiellen Eignung im eHFT zur Proteinwertschätzung von Wiederkäuerfuttermitteln zu untersuchen. Mithilfe des eHFT kann eine Schätzung von im Pansen nicht abgebautem Futter-Rohprotein (UDP) und mikrobiellem Rohprotein erfolgen. Dabei ist Ammoniak-Stickstoff (NH3-N) ein zentraler Messwert, da er während des mikrobiellen Rohproteinabbaus freigesetzt wird und den Mikroben als Stickstoffquelle dient. FI und RI wurden daher auf Basis des NH3-N sowie des berechneten mikrobiell gebundenen Stickstoffs (mN) durch die Inkubation von sechs verschiedenen Futtermitteln nach 8, 24 und 48 h Inkubation miteinander verglichen. Der NH3-N Gehalt war mit FI nach 24 und 48 h jeweils um 17 und 23% niedriger als mit RI und der mN Gehalt sank für die meisten Futtermittel mit RI mit zunehmender Inkubationszeit, während er mit FI zunächst anstieg und erst zu einem späteren Zeitpunkt abnahm. Dies deutet darauf hin, dass der Rohproteinabbau und die mikrobielle Bindung von Stickstoff mit FI langsamer und insgesamt in geringerem Umfang erfolgen. Die beiden Inokula reagierten jedoch ähnlich auf eine zusätzliche Energiequelle und zeigten starke lineare Zusammenhänge bezüglich des NH3-N, insbesondere nach 24 h (Steigung = 1.39, R² = 0.98), was auf ähnliche mikrobielle Mechanismen in Kot und Pansenflüssigkeit hindeutet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch zudem das UDP für beide Inokula geschätzt, wobei sich ein uneinheitliches Verhältnis zwischen FI und RI für die sechs untersuchten Futtermittel zeigte, was auch für den Parameter mN beobachtet wurde. Daher sind weitere Untersuchungen mit einer größeren Futteranzahl und die Prüfung mathematischer Ansätze nötig, um die Eignung von FI für die Proteinwertschätzung von Futtermitteln für Wiederkäuer im eHFT besser bewerten zu können. Zusammenfassend kann die Verwendung von Schafkot als Inokulumquelle zur in vitro-Untersuchung von Wiederkäuerfuttermitteln als geeignet bewertet werden, um Pansenflüssigkeit und somit pansenfistulierte Tiere im HFT zu ersetzen. Durch die zuverlässige Schätzung der RI-GB aus FI-GB kann perspektivisch die geschätzte RI-GB in den offiziellen und validierten Gleichungen zur Schätzung der Verdaulichkeit der Organischen Masse und Umsetzbaren Energie für Wiederkäuerfuttermittel verwendet werden. Der in dieser Arbeit angewandte methodische Ansatz bezüglich der Fütterung der Schafe, der Kotentnahme und der Herstellung des Inokulums schien daher erfolgreich gewesen zu sein, um eine hohe und konstante mikrobielle Aktivität des FI zu erzielen. Zudem zeigte sich ein hohes Potential für die Verwendung von konserviertem, insbesondere gefrorenem, Schafkot für die Anwendung im HFT sowie für die Verwendung von FI zur Proteinwertschätzung im eHFT. Für diese beiden Anwendungsbereiche sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die Eignung von FI umfassend beurteilen zu können.