Funktionelle Analyse der Gene Brachyury, Goosecoid und Myosin1d für die frühe Musterbildung und Etablierung der Körperachsen während der Embryogenese des Krallenfroschs Xenopus laevis

Abstract

During a fundamental phase of vertebrate embryonic development, gastrulation, the reorganization of the future body plan, is determined. This process controls the embryonic patterning of the antero-posterior (AP) and dorso-ventral (DV) axes, as well as the internal left-right (LR) axis. The establishment of the body axes is initially controlled by the dorsally localized Spemann organizer (SO), whereby the determination of the LR axis takes place the latest. The formation of laterality during subsequent neurulation is executed by a highly conserved mechanism of symmetry breakage within fishes, amphibians and mammals. An extracellular, monocilia-driven fluid-flow („Flow") eventually defines the laterality of the embryo, by left-asymmetric gene expression of the morphogen Nodal. Responsible for the Flow is a ciliated epithelium in the postero-dorsal region of the embryo, which undergoes morphological development and correct positioning during gastrulation and is termed GRP („gastrocoel roof plate") in the frog. Ultimately, this conserved tissue describes the left-right organizer (LRO) and guarantees proper organ situs. The origin and function of the LRO can be traced back to an epithelial organized cell structure on the dorsal surface of the gastrula, characterized by the expression of the canonical Wnt target gene and cilia marker foxj1. Following the specification of this Superficial Mesoderm (SM), the future cells of the LRO invaginate in a directed fashion during gastrulation. The patterns of cellular movement require a restructuring of the actin-cytoskeleton. These migrations, executing the future body plan, are ensured by the PCP- („planar cell polarity”) signaling pathway. This non-canonical Wnt pathway guarantees polarized alignment and migration of cells along the body axes, namely convergent extension (CE). As an organizer gene, the expression of Goosecoid (Gsc) characterizes SO and its’ properties. Contrary to the assumption that a Gsc loss of function thus inhibits gastrulation, no visible impairment was detected in the Knock-Out mouse and Knock-Down in Xenopus. Gain-of-function in the frog, which analyzed the role of Gsc during gastrulation finally demonstrated the homeobox-gene exerting a function in regulating cell movements. Overexpression resulted in impaired CE of dorsal tissue due to defective localization of nuclear proteins of the PCP signaling pathway. Gsc-induced malformations could be compensated by co-injections of associated components. In conclusion, a new function as an inhibitor of PCP-dependent CE during gastrulation was suggested. The morphogenetic movements of CE are responsible for the AP-elongation and LRO-positioning. Both, mechanical forces and cilia-based Flow functionally interact for that matter. In the invertebrate Drosophila, where neither Nodal nor cilia are expressed, organ asymmetry is ensured by internal chirality conducted via motor proteins, such as myosin1d, in a PCP-dependent manner. Similarly, in vertebrates such as Xenopus, myo1d mediates interactions of the actin cytoskeleton asymmetrically, that guarantee laterality of the organ system. The functional preservation of the non-canonical Wnt pathway could be demonstrated by co-injections of PCP core proteins, being able to restore disturbed LRO morphology. The obtained data clearly demonstrated the evolutionary, interspecific, regulation of axis asymmetry by myo1d. Since the strict spatio-temporal regulation of cell movements is fundamental for patterning, CE is propagated by another transcription factor: Brachyury (Tbxt in Xenopus). Its expression induces and controls differentiation of mesodermal cell populations, such as the notochordal cells of the dorsal midline, hence LRO. The necessity specifying progenitor cells in the SM could also be highlighted, showing to be mediated non-cell autonomously to guarantee the induction of foxj1. Additionally, the determination of both tissues is exerted by functional interactions of Tbxt with either PCP-, as well as ß-catenin-dependent Wnt signaling pathway. Loss of Brachyury affects laterality in mutants and morphants. The species-spanning Brachyury-FGF „feedback-loop" for the induction of Nodal and Foxj1 could already act in the SM and showed that function as well as the process of LR development, as suggested between Fgf8 and Brachyury, to be functionally conserved. In Xenopus, signal transduction for SM and foxj1 induction was extended by the function of the Wnt receptor frizzled-8, the ligand and Tbxt target gene wnt11b, and the ventrally acting wnt8a in Whole-Mount embryos and explant co-cultures.

Während einer fundamentalen Phase der Wirbeltier Embryonalentwicklung, der Gastrulation, wird die Anlage des zukünftigen Körperbauplans determiniert. Dieser Prozess kontrolliert die Musterbildung der Antero-Posterioren (AP) und Dorso-Ventralen (DV)- Achse, sowie der sich im Inneren offenbarenden Links-Rechts (LR)-Achse. Die Etablierung der Körperachsen wird initial über den Spemann-Organisator (SO) gesteuert, wobei die Determinierung der LR-Achse als letztes stattfindet. Die Ausbildung der Lateralität während anschließender Neurulation findet dabei durch einen, bei Fischen, Amphibien und Säugern, hoch konservierten Mechanismus des Symmetriebruchs statt. Eine extrazelluläre, Monocilien-getriebene Flüssigkeitsströmung („Flow“) definiert dabei die spätere Lateralität des Embryos, durch links-asymmetrische Expression des Morphogens Nodal. Verantwortlich für den Flow ist ein ciliertes Epithel im postero-dorsalen Bereich des Embryos, das während der Gastrulation seine korrekte Positionierung erfährt und im Frosch als GRP („gastrocoel roof plate“) bezeichnet wird. Letztlich beschreibt dieses konservierte Gewebe den Links-Rechts-Organisator (LRO) und garantiert den ordnungsgemäßen Organsitus. Den Ursprung des LRO kann man auf einen epithelialen Zellverband an dorsaler Oberfläche der Gastrula zurückführen, der durch die Expression des kanonischen Wnt-Zielgens foxj1 charakterisiert wird. Der Spezifizierung dieses Superfiziellen Mesoderms (SM) folgend, wandern die zukünftigen Zellen des LRO während der Gastrulation gerichtet in den Embryo ein. Die Bewegungsmuster verlangen dabei einer Umstrukturierung des Aktin-Cytoskeletts. Diese Wanderungen werden durch den PCP- („planar cell polarity“) Signalweg gewährleistet. Dieser nicht-kanonische Wnt-Signalweg garantiert die polarisierte Ausrichtung und Migration von Zellen entlang der Körperachsen, die konvergente Extension (CE). Als ein Organisator-Gen charakterisiert die Expression von Goosecoid (Gsc) den SO und seine Eigenschaften. Entgegen der Annahme, dass ein Funktionsverlust von Gsc somit die Gastrulation inhibiert, wurde in der Knock-Out Maus bzw. dem Knock-Down in Xenopus jedoch keinerlei Beeinträchtigung festgestellt. Es waren Funktionsgewinne im Frosch, die die Rolle von Gsc während der Gastrulation analysierten und aufzeigten, dass das Homeobox-Gen eine Funktion bei der Regulation von Zellbewegungen ausüben kann. Überexpressionen führten zu einer gestörten CE dorsaler Gewebe, aufgrund fehlerhafter Lokalisierung von Kernproteinen des PCP-Signalwegs. Gsc-induzierte Missbildungen konnten durch Co-Injektionen assoziierter Komponenten kompensiert werden. Schlussfolgernd wurde somit eine neue Funktion als Inhibitor PCP-abhängiger CE während der Gastrulation nahegelegt. Es sind die morphogenetischen Bewegungen der CE, die für die AP-Elongation und LRO-Positionierung verantwortlich sind. Dabei agieren sowohl mechanische Zugkräfte als auch der Cilien-basierte Flow. Im Invertebraten Drosophila, in dem weder Nodal, noch Cilien exprimiert sind, wird die Organasymmetrie durch interne Chiralität über Motorproteine wie Myosin1d PCP-abhängig gewährleistet. Vergleichbar werden in Vertebraten wie Xenopus durch myo1d asymmetrische Interaktionen des Aktin-Cytoskeletts vermittelt, die die Lateralität des Organsystems garantieren. Die funktionelle Konservierung des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs konnte dabei durch Co-Injektionen mit PCP-Kernproteinen aufgezeigt werden, die eine gestörte Morphologie des LRO wiederherstellten. Die gewonnenen Daten zeigten deutlich die evolutionär manifestierte, speziesübergreifende Regulation der Achsenasymmetrie durch myo1d. Da die strikte räumlich-zeitliche Regulierung von Zellbewegungen zur Musterbildung fundamental ist, wird die CE durch einen weiteren Transkriptionsfaktor propagiert: Brachyury (Tbxt in Xenopus). Dessen Expression induziert und steuert die Differenzierung mesodermaler Zellpopulationen, wie die notochordalen Zellen der dorsalen Mittellinie, somit des LRO. Die Notwendigkeit für die Spezifizierung der Vorläuferzellen im SM konnte dabei ebenfalls aufgezeigt werden, wobei diese dort nicht-zellautonom vermittelt wird, um die Induktion von foxj1 zu garantieren. Auch erfolgt die Determinierung beider Gewebe durch die funktionelle Interaktion von Tbxt mit dem PCP-, sowie dem ß-catenin-abhängigen Wnt-Signalweg. Der Brachyury Verlust manipuliert dabei die Lateralität in Mutanten und Morphanten. Der speziesübergreifende Brachyury-FGF „feedback-loop“ für die Induktion von Nodal und Foxj1 könnte dabei bereits im SM agieren und zeigte, dass sowohl Funktion als auch der Prozess der LR-Entwicklung, wie zwischen Fgf8 und Brachyury nahegelegt, funktionell konserviert scheint. In Xenopus wurde die komplexe Signaltransduktion für die SM und foxj1 Induktion um die Funktion des Wnt-Rezeptors frizzled-8, des Liganden und Tbxt-Zielgens wnt11b, sowie dem ventral agierenden wnt8a in Wohle-Mount Embryonen und Explantat-Co-Kulturen erweitert.