Development of new inhibitors directed against key enzymes of human pathogens

Abstract

Infectious diseases are one of the biggest threats to global health. The unpredictable emergence and rapid spread of viral infections, as well as the increasing frequency of antimicrobial resistance in bacterial infections, are particularly challenging due to the lack of adequate treatment options. To address these limitations, the rapid development of novel pharmaceuticals directed against essential, highly conserved enzymes of human pathogens is of urgent need. Fragment-based drug discovery (FBDD) is an approach to de novo drug design. After identifying simple, low-molecular-weight molecules (fragments) that bind the target protein, selective, high-affinity lead compounds must be developed through optimization. The objectives of this study include investigating potential inhibitors of two proteins, the papain-like protease (PLpro) of the Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and a bacterial respiratory enzyme, the Na+-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (NQR), as well as methods to support the fragment-to-lead optimization process. The PLpro is a key enzyme of SARS-CoV-2 that ensures viral replication and suppresses the antiviral immune response. It is responsible for the proteolytic processing of the non-structural proteins 1-3 (nsp1-3) of the viral polyproteins, which are important for the replication and transcription complex. Correct formation of this complex is essential for replication of the viral genome and transcription of structural genes. Furthermore, the PLpro antagonizes the interferon stimulated antiviral response through specific cleavage of the interferon stimulated gene 15 (ISG15). ISG15 is conjugated to host and viral proteins during viral infection to promote the immune response and disrupt the proper function of viral proteins. Preventing polyprotein processing and ISG15 cleavage by inhibiting the PLpro represents a promising therapeutic option for the coronavirus disease 2019 (COVID-19). The PLpro cleavage activity in presence of the hop-derived compounds xanthohumol (XN), isoxanthohumol (IX), 6-prenylnaringenin (6PN), and 8-prenylnaringenin (8PN) was determined in fluorescence-based assays using the peptide Z-RLRGG-AMC, or ISG15-rhodamine and reveals inhibition by all four compounds. Western blot analysis of interferon β treated Human Embryonic Kidney (HEK) cell lysates validates the inhibition of ISG15 cleavage through IXN. Antiviral activity of XN and 6PN is shown in infection models using Caco-2 cells. Therefore, these hop-derived compounds are promising starting points for developing new antiviral drugs. The NQR is a central enzyme in the energy metabolism of bacteria, including pathogens such as Vibrio cholerae, and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. By coupling the oxidation of NADH with the reduction of ubiquinone, it translocates sodium ions or protons from the cytoplasm in the periplasm. Through this translocation, electrochemical gradients, the sodium or proton motive force are generated across the cytoplasmic membrane. These motive forces are required for several metabolic processes, like substrate uptake, ATP synthesis, motility, or drug efflux by multidrug-resistant (MDR) efflux pumps. Interrupting the binding of NADH and, consequently, the generation of the electrochemical gradients could be a promising approach for developing novel antibiotics and new treatment options for multidrug-resistant pathogens. The compound [1-(4-chlorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]methanol (CPTM) was selected from the fragments identified during a crystallographic screening against the NqrF subunit of V. cholerae. The fragment binds in the part of the NADH-binding pocket where the adenosine residue of the NADH usually binds. It inhibits the NADH-oxidizing activity of the NqrF subunits of V. cholerae, K. pneumoniae, and P. aeruginosa, as well as the NQR complex of V. cholerae in a mixed mode of inhibition, with a significantly stronger inhibitory effect on the NQR complex. In growth assays, CPTM exhibited antibacterial activity against V. cholerae, and multidrug-resistant strains of K. pneumoniae, and P. aeruginosa. In a combinatorial treatment, the efficacy of erythromycin increases when combined with CPTM in V. cholerae and K. pneumoniae but decreases in P. aeruginosa. The inhibition by occupying the NADH-binding pocket and the identification of the promising inhibitor CPTM are basis for structure-based optimization to develop antibacterial agents. Specific NQR inhibition opens the door to combinatorial therapy options for multidrug-resistant pathogens, which could restore the efficacy of current antibiotics. In FBDD, the identification of initial hits is followed by an optimization to improve their affinity, specificity, and physicochemical properties through fragment growing, merging, or linking strategies. To support single steps of the subsequent analysis to identify the candidates with improved properties, many computational tools are available. EvaMol is a software that integrates several of these tools to cover the entire evaluation. It prepares a receptor and the database of input molecules, obtained by the optimization. In the following docking step, the best-fitting pose of each molecule is calculated. Then, two independent scoring algorithms assess the binding of the docked molecules. Finally, physicochemical properties and ligand efficiency metrics are calculated. This helps to prioritize the candidate molecules with the most promising features and accelerates fragment-to-lead development in early drug discovery. Overall, the findings of this study lay the foundation for the development of novel antiviral and antibacterial pharmaceuticals and provide a tool to facilitate the optimization process in FBDD pipelines. This contributes to the urgent need for novel treatments caused by infectious diseases.

Infektionskrankheiten sind eine der größten Herausforderungen für die globale Gesundheit. Das unvorhersehbare Auftreten und die rasche Ausbreitung von Virusinfektionen sowie die zunehmende Häufigkeit antimikrobieller Resistenzen bei bakteriellen Infektionen stellen eine besondere Herausforderung dar, da geeignete Behandlungsmöglichkeiten fehlen. Um diesen Einschränkungen entgegenzuwirken, ist die schnelle Entwicklung neuer Arzneimittel, die gegen essenzielle, hochkonservierte Enzyme humaner Pathogene gerichtet sind, dringend notwendig. Fragment-basierte Wirkstoffentdeckung (engl. Fragment-based drug design = FBDD) ist eine Möglichkeit für das De novo Design von Medikamenten. Nach der Identifizierung einfacher, niedermolekularer Moleküle (Fragmente), die das Zielprotein binden, müssen durch Optimierung selektive, hochaffine Leitverbindungen entwickelt werden. Zu den Zielen dieser Arbeit gehört die Untersuchung potenzieller Inhibitoren zweier Proteine, der Papain-artigen Protease (PLpro) des Schweren Akuten Respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) und eines bakteriellen Atmungsenzyms, der Na+-translozierenden NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NQR), sowie die Entwicklung von Methoden zur Optimierung von Fragmenten zu Leitstrukturen. Die PLpro ist ein Schlüsselenzym in SARS-CoV-2, das die virale Replikation gewährleistet und die antivirale Immunantwort unterdrückt. Es ist verantwortlich für die proteolytische Prozessierung der nicht-strukturellen Proteine 1-3 (nsp1-3) der viralen Polyproteine, die für den Replikations- und Transkriptionskomplex wichtig sind. Die korrekte Bildung dieses Komplexes ist für die Replikation des viralen Genoms und die Transkription struktureller Gene unerlässlich. Des Weiteren wirkt die PLpro der interferonstimulierten antiviralen Antwort durch spezifische Abspaltung des interferon-stimulierten Gens 15 (ISG15) entgegen. ISG15 wird während der Virusinfektion an Wirts- und Virusproteine gebunden, um die Immunantwort zu fördern und die richtige Funktion der viralen Proteine zu stören. Die Polyproteinprozessierung und ISG15 Abspaltung durch Inhibition des PLpro zu verhindern, stellt eine vielversprechende therapeutische Option für die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) dar. Die PLpro proteolytische Aktivität wurde in Gegenwart der aus Hopfen gewonnenen Verbindungen Xanthohumol (XN), Isoxanthohumol (IX), 6-prenylnaringenin (6PN) und 8-prenylnaringenin (8PN) in fluorenzenzbasierten enzymatischen Tests unter Verwendung das Peptids Z-RLRGG-AMC oder ISG15-Rhodamin bestimmt und zeigt eine Hemmung durch alle vier Verbindungen. Eine Western-Blot-Analyse von mit Interferon β behandelten humanen embryonalen Nierenzelllysaten (HEK) bestätigt die Hemmung der ISG15-Spaltung durch IXN. Die antivirale Aktivität von XN und 6PN hat sich in Infektionsversuchen in humanen Zellen der Caco-2 Zelllinie bestätigt. Daher sind diese aus Hopfen gewonnenen Verbindungen vielversprechende Ausgangspunkte für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente. Die NQR ist ein zentrales Enzym im Energiestoffwechsel von Bakterien, einschließlich Krankheitserregern wie Vibrio cholerae sowie multiresistenten Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa. Durch die Kopplung der Oxidation von NADH mit der Reduktion von Ubichinon transloziert es Natriumionen oder Protonen aus dem Zytoplasma in das Periplasma. Durch diese Translokation werden elektrochemische Gradienten, die Natrium- oder Protonenantriebskraft über die Zytoplasmamembran erzeugt. Diese Antriebskräfte werden für viele metabolische Prozesse wie z.B. die Aufnahme von Substraten, die ATP-Synthese, für die Motilität oder das Herausschleusen von Medikamenten durch Multiresistenz (MDR) vermittelnde Effluxpumpen benötigt. Die Unterbrechung der Bindung von NADH und somit der Erzeugung elektrochemischer Gradienten könnte ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Antibiotika und neuer Behandlungsmöglichkeiten für multiresistente Pathogene sein. CPTM wurde von den Fragmenten ausgewählt, die während eines kristallographischen Screenings gegen die NqrF Untereinheit aus V. cholerae identifiziert wurden. Das Fragment bindet in dem Teil der NADH-Bindungstasche, in dem normalerweise der Adenosin-Rest des NADH bindet. Es inhibiert die NADH-oxidierende Aktivität der NqrF-Untereinheiten aus V. cholerae, K. pneumoniae und P. aeruginosa, sowie den NQR-Komplex aus V. cholerae weder rein kompetitiv noch allosterisch, sondern auf eine gemischte Inhibitionsart, wobei der inhibitorische Effekt auf den NQR-Komplex stärker ist als auf die isolierten NqrF Untereinheiten. In Wachstumsversuchen zeigte CPTM antibakterielle Aktivität gegen V. cholerae sowie gegen multiresistente Stämme von K. pneumoniae und P. aeruginosa. Bei einer Kombination von CPTM mit anderen Antibiotika erhöht sich die Wirksamkeit von Erythromycin in Gegenwart von CPTM gegenüber V. cholerae und K. pneumoniae, erniedrigt jedoch gegenüber P. aeruginosa. Die Inhibition durch Besetzung der NADH-Bindungstasche und die Identifizierung des vielversprechenden Inhibitors CPTM bilden die Grundlage für die strukturbasierte Optimierung zur Entwicklung antibakterieller Wirkstoffe. Die spezifische Inhibition der NQR eröffnet Möglichkeiten für kombinierte Therapien gegen multiresistente Krankheitserreger, wodurch die Wirksamkeit aktueller Antibiotika wiederhergestellt werden könnte. Nach der Identifizierung der ersten Treffer erfolgt bei der FBDD eine Optimierung durch Vergrößerung des ursprünglichen Moleküls, sog. Fragment Wachstum, oder durch Zusammenführung und Verknüpfung mehrerer Moleküle, um deren Affinität, Spezifität und physikochemischen Eigenschaften zu verbessern. In der nachfolgenden Suche nach geeigneten und potenziell besseren Wirkstoffkandidaten, stehen zahlreiche unterschiedliche computergestützte Verfahren zur Verfügung. Um diese Computer gestützten Verfahren zu automatisieren und die Identifikation verbesserter Moleküle zu erleichtern, wurde eine Software -EvaMol- entwickelt, die mehrere dieser Verfahren integriert, und so eine Bewertung neuer Wirkstoffkandidaten zulässt. EvaMol bereitet die strukturellen Daten des analysierten Proteins sowie eine Datenbank, die mögliche Wirkstoffmoleküle enthält, für die Analyse vor. Im Folgenden werden über sog. molekulares Docking die optimale Position und Konformation jedes Moleküls berechnet. Anschließend bewerten zwei unabhängige Algorithmen die Bindung der so gedockten Moleküle, um deren Affinität abzuschätzen. Schließlich werden physikochemische Eigenschaften und Kennzahlen zur Effizienz der Bindung dieser Moleküle berechnet. Dieses Verfahren hilft bei der Priorisierung der Wirkstoffkandidaten mit den vielversprechendsten Eigenschaften und beschleunigt so die Entwicklung von Fragmenten zu Leitstrukturen in der frühen Arzneimittelforschung. Insgesamt legen die Ergebnisse dieser Arbeit den Grundstein für die Entwicklung neuer antiviraler und antibakterieller Arzneimittel und bieten eine Software, die den Optimierungsprozess in FBDD-Pipelines erleichtert. Dies trägt dazu bei, den dringenden Bedarf an neuen Behandlungsmethoden für Infektionskrankheiten zu decken.