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Doctoral Thesis
2024
Conformational dynamics of proteins in bacterial pathogens and the innate immune response
Conformational dynamics of proteins in bacterial pathogens and the innate immune response
Abstract (English)
Global health is facing two major threads, the rapid rise of multi-drug resistant bacterial pathogens and the increase autoimmune diseases. Therefore, studying the components of host-pathogen interactions is crucially important for the development of novel drugs and diagnostic tools to fight these threats. Both, virulence factors of pathogenic bacteria and the components of the host’s innate immune response are build up by multimeric protein complexes. In order to understand how these systems respond to different conditions and environments and to uncover the underlying molecular mechanisms, the conformational dynamics of these proteins must be resolved.
This study focuses on the two important examples of a host-defence protein, S100A8/A9, and a bacterial virulence factor, the Na+-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (NQR).
The heterodimeric protein complex S100A8/A9 is secreted in very high amounts by immune cells at sites of infection and tissue damage. S100A8/A9 is a key element of the innate immune system. It strongly activates inflammatory response and exhibits antimicrobial properties by binding of essential transition metal nutrients. Therefore it is defined as a danger-associated molecular pattern (DAMP). Its role as a DAMP during inflammation and absence in healthy tissue defines S100A8/A9 is used as an excellent biomarker for a variety of inflammatory diseases in human and veterinary medicine. Only the human S100A8/A9 is thoroughly characterised so far. Imaging of S100A8/A9 by a tracer molecule would allow for sensitive and accurate imaging of pathogenic or sterile inflammation. Here, a new protocol for fast and and efficient isolation of human and porcine S100A8/A9 is established, which is also applicable to S100A8/A9 of other species. The characterisation of porcine S100A8/A9 revealed similar properties with respect to structure and metal binding to human S100A8/A9, while the antimicrobial properties of the porcine protein are less pronounced than in the human orthologue. The structures of human S100A9 in complex with different tracer molecules were determined by X-ray crystallography, revealing that the molecular benzimidazole core of the tracer binds into a dynamically adapting pocket of S100A9. Applying a newly established tryptophan fluorescence-based assay, it was shown that the affinity of the tracer is not affected by different imaging tags attached to the benzimidazole core. Since the bezimidazole core exhibits non-favourable pharmacokinetic properties, novel lead compounds for the targeting of S100A8/A9 in inflammation have to be established. New lead structures, which could serve as novel molecular cores, were identified by fragment-based crystallographic screening. As exemplified by the benzimidazole imaging tracers, S100A8/A9 ligands have to fulfil the requirements of the dynamic binding pocket. The identified molecules represent an excellent starting point for the development of a novel class of imaging probes for the sensitive detection of inflammation.
The NQR is part of the respiratory chain of the human pathogen Vibrio cholerae. It couples the oxidation of NADH and the reduction of ubiquinone to the translocation of Na+ from the cytoplasm to the periplasm. The resulting Na+ electrochemical gradient, the sodium motive force, is vital for V. cholerae and drives several processes critical for pathogenesis, like e.g. movement of the flagellum and efflux of antibiotics. NQR-activity is linked to the expression of pathogenic factors including the cholera toxin and is therefore classified as a virulence factor itself. Since the NQR has no homologs in humans and is widespread among Gram-negative pathogenic bacteria, it is a promising target for the development of novel classes of antibiotics. However, the mechanism of electron transfer and the coupled sodium translocation as well as the quinone binding site had been elusive. Based on first structural information on the NQR, which exhibited unusual large distances between redox cofactors, drastic conformational changes had been proposed (Steuber et al., 2014). In this study, the structure of the NQR with substrates or inhibitors bound was determined by single particle cryo electron microscopy. The structures reveal that the coupling of electron transfer to conformational changes in the NQR subunits NqrC and NqrF are governed by the redox state of the intramembrane [2Fe-2S] cluster between NqrD/E, defining the NQR as a conformationally coupled redox pump. Furthermore, the binding site of ubiquinone and the NQR inhibitor HQNO was located in NqrB. Sodium ions were identified bound in NqrB, which could represent exit sites of the sodium translocation path. These findings were confirmed for the NQR of Prevotella byrantii by homology modelling. Taken together, the molecular mechanism described for the V. cholerae NQR applies also to NQRs from other organisms and homologous complexes. The described NQR mechanism and substrate binding sites lay the foundation for the structure-based design of NQR-inhibitors which could serve as new antibacterial drugs.
In summary, the findings presented in this study promote the development of novel diagnostic tools and new antibiotics to combat the emerging threats of autoimmune diseases and multidrug resistant bacterial pathogens.
Abstract (German)
Der Anstieg von bakteriellen Infektionen, die durch antibiotikaresistente Bakterien verursacht werden, sowie die Zunahme von Autoimmunerkrankungen, stellen akute Bedrohungen für die
globale Gesundheit der Menschheit dar. Daher ist es von großer Wichtigkeit, die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger zu erforschen, um so die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Diagnoseverfahren gegen diese Bedrohungen zu ermöglichen. Bakterielle Virulenzfaktoren sowie die Komponenten der angeborenen Immunantwort des Wirts sind aus Proteinen aufgebaut. Um die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, wie Proteine unter verschiedenen Bedingungen und Umgebungen ihrer Funktion nachkommen, müssen die konformationellen Dynamiken der Proteine betrachtet werden. Die vorliegende Studie fokussiert sich auf zwei wichtige Vertreter der Proteine der angeborenen Immunantwort (S100A8/A9), sowie auf einen bakteriellen Virulenzfaktor, die Na+-translozierende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NQR). S100A8/A9 wird in großen Mengen von Immunzellen am Ort der Infektion sekretiert. Es zeigt antimikrobielle Eigenschaften durch das Binden von für Bakterien essentiellen Übergangsmetallen.
S100A8/A9 ist eine Komponente der Signalkaskaden der Inflammationsreaktion und wird daher als ”danger-associated molecular pattern“ (DAMP) klassifiziert. DAMPs sind Moleküle, die anderen Zellen eine Gefährdung signalisieren. Die Funktion als DAMP, sowie die Tatsache, dass S100A8/A9 in gesundem Gewebe nicht vorhanden ist, machen S100A8/A9 zu einem geeigneten Biomarker für eine Vielzahl von Entzündungskrankheiten der Human- und Veterinärmedizin. Zu Beginn der Studie lagen lediglich für das humane S100A8/A9 Protein Erkenntnisse zu Struktur und Funktion vor. Die Visualisierung von S100A8/A9 mittels kleiner, spezifisch
bindender Moleküle, sogenannter "tracer“, würde es ermöglichen, sterile als auch durch Infektionen hervorgerufene Entzündungen in Geweben von erkrankten Personen zu verfolgen. In dieser Studie wird ein verbessertes Verfahren zur schnellen und einfachen Expression und Aufreinigungvon humanem sowie porzinem S100A8/A9 beschrieben, welches auch für S100A8/A9 Homologe anderer Organismen anwendbar ist. Porzines S100A8/A9 weist Ähnlichkeit zum humanem S100A8/A9 hinsichtlich der dreidimensionalen Struktur und der metallbindenden Eigenschaften auf, ist aber in seiner antimikrobiellen Wirkung schwächer als das humane S100A8/A9. Die Strukturen von S100A9 mit gebundenen Benzimidazol-Liganden wurden mittels Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Liganden von S100A9 die Eigenschaft besitzen, sich der konformationellen Dynamik der Bindetasche anzupassen. Durch Beobachtung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz von S100A9 wurde nachgewiesen, dass Benzimidazol-Liganden, die mit geeigneten Markermolekülen modifiziert sind, die Affinität des so markierten Liganden nicht beeinflusse. Da Benzimidazole keine geeigneten pharmakokinetischen Eigenschaften besitzen, wurden in vorliegender Studie neue Leitmoleküle identifiziert, die an S100A8/A9 binden. Dies gelang mittels kristallographischem Screening von Fragmenten (Molekülen).
Die NQR ist Teil der Atmungskette des humanpathogenen Bakteriums V. cholerae. Das Enzym koppelt die Oxidation von NADH und die Reduktion von Ubichinon an die Translokation von Natriumionen vom Zytoplasma ins Periplasma. Der resultierende elektrochemische Natriumionengradient treibt entscheidende Prozesse in Vibrio cholerae an, die für die Pathogenität des Erregers maßgeblich sind, wie z.B. Motilität, oder den Export toxischer Substanzen wie Antibiotika. Da die Aktivität der NQR mit der Expression von Virulenzfaktoren, wie zum Beispiel dem Choleratoxin, assoziiert ist, gilt auch die NQR als Virulenzfaktor. Die NQR hat keine Homologe
zu NADH-Dehydrogenasen des Menschen und ist unter Gram-negativen Pathogenen weit verbreitet, weshalb die NQR als vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuartiger Antibiotika ist. Zu Beginn der Studie war der Mechanismus des Elektronentransfers und der damit gekoppelte Natriumtransport der NQR, sowie die Bindestelle des Substrats Ubichinon, noch nicht aufgeklärt. Die verfügbare Struktur der NQR (Steuber et al., 2014) zeigt das Enzym in einer Konformation, in der die Anordnung der Kofaktoren keinen produktiven Elektronentransfer von NADH zu Ubichinon ermöglichen könnte. In vorliegender Arbeit wurden mehrere kryoelektronenmikroskopische Strukturen der NQR in verschiedenen Konformationen und im Komplex mit verschiedenen Substraten und Inhibitoren bestimmt. Die Strukturen zeigen, dass die Kopplung des Elektronentransfers an Konformations¨anderungen in den NQR Untereinheiten NqrC und NqrF durch den Redoxzustand des Intramembran-[2Fe-2S]-Clusters zwischen NqrD/E gesteuert werden. Dies demonstriert, dass die NQR als konformationsgekoppelte Redoxpumpe agiert. Des weiteren konnten die Ubichinon- und Inhibitorbindestellen der NQR identifiziert werden. Ausserdem konnten Bindestellen für Natrium-Ionen in potenziellen Austrittsstellen des Natriumkanals identifiziert werden.
Die hier gewonnenen Erkenntnisse wurden auch für die NQR von Prevotella bryantii durch homologie-basierte Modellierung bestätigt. Daher kann der Mechanismus der NQR, der hier für V. cholerae gezeigt wurde, als allgemeingültig für die NQR-Familie angesehen werden. Der hier gefundene Mechanismus sowie die entdeckte Ubichinonbindestelle der NQR legen die Grundlage für die strukturbasierte Entwicklung von NQR-Inhibitoren für die Weiterentwicklung hin zu neuen Antibiotika. Die Strukturen von S100A9 in Komplex mit den Benzimidazol-Liganden zeigen, dass eine Voraussetzung für eine gute Bindung die Anpassung an die Dynamik der Bindetasche ist. Die neu identifizierten Fragmente sind Ausgangspunkt für die Entwicklung neuartiger Moleküle zur Visualisierung von Entzündungsreaktionen. Die in dieser Arbeit präsentierten Resultate leisten einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung von neuartigen Antibiotika und Diagnoseverfahren, um den Gefahren, die von antibiotikaresistenten Pathogenen und Autoimmunerkrankungen ausgehen, entgegenzuwirken.
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2027-05-20
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Institute of Biology
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2025-01-15
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English
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Classification (DDC)
570 Biology
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Sustainable Development Goals
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@phdthesis{Hau2024,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/17653},
author = {Hau, Jann-Louis},
title = {Conformational dynamics of proteins in bacterial pathogens and the innate immune response},
year = {2024},
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