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Doctoral Thesis
2025

Neuartige Zielproteine für Antibiotika: Respiratorische Flavoproteine aus pathogenen Bakterien

Vering, Jonatan

Abstract (German)

Der steigende Anteil antibiotika-resistenter, bakterieller Erreger stellt eine immer größer wer-dende Bedrohung für das Gesundheitssystem von Entwicklungsländern und Industrienationen dar. Mangelnde Disziplin und Fehlverhalten beim Einsatz von Antibiotika sind dabei eine trei-bende Kraft für das vermehrte Auftreten resistenter Stämme. Das Ausmaß des Problems wird durch den Aufruf zur Entwicklung neuartiger Antibiotika durch die Weltgesundheitsorganisa-tion deutlich. Die Entwicklung neuartiger Antibiotika gegen die γ-Proteobakterien Acinetobac-ter baumannii, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa hat laut der WHO höchste Priorität. Flavinkofaktoren sind in allen lebenden Organismen essenziell. Ihre Funktionen sind vielseitig. Am häufigsten sind Flavine allerdings an der Katalyse von Redoxreaktionen beteiligt. Flavine sind somit auch ein wichtiger Bestandteil der Atmungskette von Prokaryoten und Eukaryoten. Die Na+ translozierende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Na+-NQR) stellt eine Eintrittsstelle für Elektronen in die Atmungskette einer Vielzahl von γ-Proteobakterien dar, darunter klinisch relevante Pathogene. Die Na+-NQR koppelt die Redox-Reaktion an den Aufbau eines Natrium-Gradienten zwischen Cytoplasma und Periplasma. Dieser Gradient wird für die ATP-Gewin-nung, die Osmoregulation und den Metabolitentransport genutzt, und ist somit auch hinsicht-lich der Virulenz eines Erregers bedeutsam. Diese Tatsache macht die Na+-NQR zu einem Ziel-protein für neue Antibiotika. Die Na+-NQR nutzt vier Flavin-Kofaktoren. Zwei Flavinmononuk-leotide sind über eine Phosphodiesterbindung kovalent an das Enzym gebunden. Diese Bin-dung wird durch Enzyme der ApbE Familie katalysiert, die eine Domäne aus konservierten Aminosäureresten für die Insertion des Flavinkofaktors erkennen. Diese Enzymklasse kommt ausschließlich in Prokaryoten vor. Neben der Na+-NQR werden auch weitere Enzyme aus der bakteriellen Atmungskette durch die ApbE Familie kovalent FMNyliert. ApbE stellt somit ein weiteres, vielversprechendes Zielprotein zur Entwicklung neuer Inhibitoren und Antibiotika dar. Erstes Ziel der vorliegenden Arbeit ist die umfassende Charakterisierung des Aktivzentrums der FAD-Domäne der NqrF-Untereinheit der Na+-NQR. Die FAD-Domäne katalysiert die initiale Oxidation von NADH. Aus vorangegangenen strukturbiologischen Untersuchungen der NADH-Bindetasche in der FAD-Domäne aus K. pneumoniae ergaben sich Hinweise für eine weitere NADH (oder NAD+) Bindetasche. Aufgrund dieser Beobachtung wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese zweite NAD(H)-Bindetasche von katalytischer Relevanz ist. Durch orts-spezifische Mutagenese, sowie durch kinetische und spektroskopische Analysen wurde ge-zeigt, dass NADH und NAD+ an diese Tasche binden. In der FAD-Domäne der Na+-NQR wird durch diese zweite NADH-Bindetasche eine hohe Affi-nität des Substrats gewährleistet. Dies wurde in vitro unter Verwendung der gereinigten Na+-NQR aus Vibrio cholerae gezeigt, und in vivo in Wachstumsexperimenten mit V. cholerae be-stätigt. Des Weiteren wurde der Mechanismus der Enzyme der ApbE-Familie untersucht. Es war bekannt, dass alle Aminosäurereste der konservierten Tasche des Zielproteins, in der die FMNylierung stattfindet, einen Einfluss auf die FMN-Transferaseaktivität von ApbE bzw. ho-mologen Enzymen haben. Es wurde gezeigt, dass ein Peptid, welches auf der Aminosäurese-quenz der konservierten Flavinylierungstasche basiert, von Enzymen der ApbE-Familie er-kannt und kovalent FMNyliert wird. Dies ermöglicht nun erstmals eine funktionelle Analyse der Enzyme der ApbE-Familie. Die fragment-basierte Identifizierung von neuen Wirkstoffen („fragment-based drug dis-covery“) ist ein kristallographisches Hochdurchsatzverfahren, um kleine Moleküle („frag-ments“) zu identifizieren und weiterzuentwickeln, die an biologische Zielmoleküle wie bei-spielsweise Proteine binden. Hier wurden Enzyme der ApbE-Familie als Zielprotein verwendet, um neuartige Inhibitoren zu entwickeln, die gegen diese essenziellen, bakteriellen Enzyme wirken. Abschließend wurde ein kristallographiebasiertes Fragment Screening durchgeführt. Dazu ist es notwendig, ein Kristallsystem zu etablieren, bei dem das aktive Zentrum gut zugänglich ist. Außerdem müssen die Kristalle eine hohe Toleranz gegenüber DMSO haben, welches das Lö-sungsmittel ist, in dem die Fragmente gelöst werden. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass es vorteilhaft ist, mehrere Homologe eines Enzyms zu kristallisieren, um ein Kristallsystem zu identifizieren, welches für den Fragment Screening Ansatz geeignet ist. Nur eines von vier untersuchten Kristallsystemen war für das Fragment Screening geeignet. Dies ermöglichte die Identifizierung von sechs Vorläufermole-külen, die in die Substratbindetasche von ApbE binden. Die gezeigten Daten sind ein wichtiger Baustein für das Verständnis der Mechanismen der Na+-NQR und der ApbE Familie. Die Studien sind grundlegend für das Design von hochaffinen Inhibitoren dieser Enzyme.

Abstract (English)

The increasing share of antibiotic-resistant bacterial pathogens is an alarming threat for the public healthcare system of developing countries and industrial nations. A lack of discipline and knowledge in the application of antibiotics are the driving forces resulting in the increase of resistant strains. The extent of the problem is underlined by a study published by the World Health Organization, concluding in a call for research and development of novel antibiotics. According to the World Health Organization, the development of novel antibiotics against the γ-Proteobacteria Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa is of highest priority. Flavin cofactors are essential to all living organisms. Their function is diverse, however, most commonly they are involved in the catalysis of redox reactions. Therefore, flavins are important components of the respiratory chain of prokaryotes and eukaryotes. The Na+-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (Na+-NQR) represents the entry point of electrons into the respiratory chain of many γ-Proteobacteria, including relevant human pathogens. The Na+-NQR couples a redox reaction to the formation of a sodium gradient across the cyto- plasmic membrane. This gradient is utilized for the generation of ATP, osmoregulation and the transport of metabolites. Therefore, this gradient is also important with respect to the virulence of a pathogen. Thus, the Na+-NQR is a promising target for the development of novel antibiotics. The Na+-NQR utilizes four flavin cofactors. Two FMN cofactors are covalently attached to the protein via a phosphodiester bond. This bond is established by enzymes belonging to the ApbE family, which recognize a domain formed by conserved amino acid residues for insertion of the flavin cofactor. The ApbE family is exclusive to prokaryotes. Besides the Na+-NQR, ApbE also catalyzes the flavinylation of other proteins involved in the respiratory chain. Therefore, ApbE represents another promising target for the development of novel inhibitors and antibiotics. The first aim of this work was the comprehensive characterization of the active site of the FAD domain of the NqrF subunit of the Na+-NQR. The FAD domain catalyzes the initial oxidation of NADH. Structural investigations of the FAD-domain of K. pneumoniae have indicated the presence of a second NADH (or NAD+) binding pocket. Based on this observation, the hypothesis was put forward that this second NAD(H) binding pocket is of catalytic relevance. By site directed mutagenesis and kinetic and spectroscopic analyses, it was demonstrated that NADH and NAD+ bind to this pocket. In the FAD domain of Na+-NQR, this second NADH binding site ensures high affinity of the substrate. This was also demonstrated in vitro using purified Na+-NQR from Vibrio cholerae and confirmed in vivo in growth experiments with V. cholerae. Additionally, the mechanism of the enzymes belonging to the ApbE-family was investigated. It was known that all amino acid residues of the conserved pocket of the target protein, where FMNylation takes place, have an influence on the FMN transferase activity of ApbE and its homologous enzymes. It was shown that a peptide based on the amino acid sequence of the conserved flavinylation pocket is recognized and covalently FMNylated by ApbE-like enzymes, paving the way for their functional analysis. Fragment-based drug discovery is a high-throughput, crystallographic approach for the identification and development of small molecules (“fragments”) which bind to a biological target molecule, e.g. a protein. Here, enzymes from the ApbE family were used as a target to develop novel inhibitors acting against these essential bacterial enzymes. This requires the establishment of a crystal system with an accessible active site. Additionally, crystal growth must be reliable, and the crystals are required to be highly tolerant towards DMSO, the solvent used for the fragments. Therefore, the hypothesis was developed that it is beneficial to establish crystal systems of several homologous enzymes to identify the most target protein suited for a fragment screening approach. It was shown that only one of the four established crystal systems was suitable for fragment screening. Subsequently, six molecules binding to the substrate binding pocket of ApbE were identified by means of fragment screening. The presented data expands the understanding of the mechanisms of the Na+-NQR and of enzymes from the ApbE family. This is paving the way for the development of high-affinity inhibitors against these bacterial target proteins.

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2025-06-27

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Vering, J. (2025). Neuartige Zielproteine für Antibiotika: Respiratorische Flavoproteine aus pathogenen Bakterien. https://doi.org/10.60848/12981

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https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/18050
 https://doi.org/10.60848/12981

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German

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570 Biology

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