Mikrobiologische und biochemische Analyse der Fermentationseigenschaften von Lactobacillus paralimentarius AL28 und Lactobacillus plantarum AL30 in Sauerteigen aus Pseudozerealien

Abstract

Pseudocereals are absent of gluten and therefore are important for people having a gluten-intolerance. Today no commercial starter cultures are available for sourdough fermentations with pseudocereals. This PHD-Thesis shows results of the characterisation of L. paralimentarius AL28 and L. plantarum AL30 concerning an application in pseudocereal sourdoughs. The fermentation properties of the strains, applied as single strains and in combination, were assessed in laboratory scale fermentations with amaranth and buckwheat. The fermentation studies were performed with a dough yield of 200 and over a period of two to ten days at 30°C with daily refreshment step. The investigated strains acidified the sourdoughs fast within the first two propagation steps as single strains as well as in combination (approximately pH 4). In amaranth higher total titratable acidity (TTA) -values (TTA between 25 and 30) were measured than in buckwheat (TTA of 20). 16S rDNA / 28S rDNA-PCR sequencing and RAPD-PCR were applied to determine the bacterial and eucaryotic species affiliation, respectively, and to trace specific strains during the fermentation process. The analysed strains competed against the autochthonous microbiota with the result of suppression the majority of yeasts and moulds as well as strains of their own species within the first 12 h of sourdough fermentation. They also suppressed an autochthonous microbiota grown up to 10^8 cfu/g sourdough. Single strains as well as the combination of both strains dominated the microflora in all tested flours / fermentation batches. Both strains displayed reproducible results concerning their over-all fermentation characteristics. L. paralimentarius AL28 and L. plantarum AL30, respectively, dominated the LAB viable counts in all flours after 10 days of fermentation as single strains (>/= 68 % and >/= 98 % of LAB, respectively) as well as in combination. In the latter case strain L. plantarum AL30 was especially competitive in buckwheat (AL28:AL30 = 1:1), more than in amaranth (AL28:AL30 = 4:1). The strains were characterised by their short lag-phase of </= 2 h which was followed by the log-phase ending in the stationary-phase of growth already after a fermentation time of 9 h. For both inoculated strains colony counts ranged between 10^9 and 10^10 cfu/g sourdough. The aroma profile of the strains was analyzed by HPLC. Furthermore, the strains were characterised concerning their metabolic profile using tests for proteolytical activity, api 50CH® tests as well as starch degradation. Both strains produced mannitol in mMRS5-broth but not in the pseudocereal doughs. They produced up to 214 mM lactate. Neither increased proteolytical nor amylolytical activity was detected. The comparison of the strains investigated in this thesis with commercial starter cultures showed an equal or superior fermentation quality. They even produced 48 mM more lactate. The fermentation parameters of L. paralimentarius AL28 and L. plantarum AL30 were stable at various propagation temperatures. Even under suboptimum temperature (25°C) the fermentation behaviour of the combination of both strains was comparable with the behaviour of commercial starter cultures. At 25°C the strains produced 20 mM more lactate than the commercial starter culture IS1 at a fermentation temperature of 30°C. The above results show that L. paralimentarius AL28 and L. plantarum AL30 have competitive and stable fermentation properties. They fulfil all requirements of a potential sourdough starter culture from the microbiological point of view. Therefore, they are interesting candidates for an application in sourdough fermentation.

Pseudozerealien besitzen kein Gluten und sind daher für Menschen mit Zöliakie von Bedeutung. Es gibt derzeit keine kommerziell erhältlichen Starterkulturen für Sauerteige aus Pseudozerealien. In der vorliegenden Arbeit wurden die Stämme L. paralimentarius AL28 und L. plantarum AL30 in ihrer Eignung als Starterkulturen für Sauerteige aus Pseudozerealien evaluiert. In den Analysen wurden Amaranth und Buchweizen eingesetzt. Die Teige wurden im Labormaßstab bei 30°C und einer Teigausbeute 200 zwischen zwei und zehn Tagen mit täglichem Anfrischen geführt. L. paralimentarius AL28 und L. plantarum AL30 säuerten sowohl einzeln als auch in Kombination Teige aus Amaranth und Buchweizen innerhalb der ersten zwei Propagationsschritte auf pH-Werte von rund 4 und Säuregrade von 25 bis 30 (Amaranth) bzw. 20 (Buchweizen) an. Die zu evaluierenden Stämme wurden innerhalb der jeweiligen Fermentationen, ebenso wie die Mikroflora der Teige, über RAPD-PCR und Sequenzierung der 16S rDNA bzw. 28S rDNA identifiziert und voneinander differenziert. Darauf basierend zeigte sich, dass beide Stämme wettbewerbsstark sind. Sie setzten sich gegen die autochthone Milchsäurebakterien-Mikroflora durch, darunter auch gegen Stämme derselben Spezies. Sie verdrängten den Großteil an Hefen und Pilzen bereits innerhalb der ersten 12 h. In Ausnahmefällen konnten Hefen, Pilze und vereinzelt auch Milchsäurebakterien über eine längere Fermentationsdauer nicht vollständig zurückgedrängt werden. Dennoch setzten sie sich gegen eine Mikroflora durch, die bereits auf 10^8 KbE / g Teig angewachsen war. Weiterhin dominierten die beiden Stämme die Milchsäurebakterien-Mikroflora in den Teigen nach 10 Tagen immer mit einem Anteil >/= 68 %. L. paralimentarius AL28 eignete sich diesbezüglich sowohl als Einzelstammstarter-, wie auch als Mehrstammstarterkultur in beiden Pseudozerealien. L. plantarum AL30 schien besonders im Buchweizen als Teil der Mehrstammstarterkultur geeignet, da hier beide Stämme im Verhältnis 1:1 vorlagen, was im Amaranth nicht der Fall war (AL28:AL30 = 4:1). Als Einzelstammstarterkultur erreichte er sowohl in Buchweizen, als auch in Amaranth Anteile >/= 98 %. Die Analysen einzelner Propagationsschritte ergaben, dass nach einer kurzen lag-Phase (</= 2 h) die exponentielle Wachstumsphase nach 9 h Fermentationszeit in die stationäre Phase überging und sich Keimzahlen zwischen 10^9 KbE / g und 10^10 KbE / g Teig einstellten. Die Bildung literaturbekannter Aroma-Markersubstanzen wie z.B. Laktat, Acetat oder Mannitol wurden im Sauerteig und Kultivierungsmedium über HPLC analysiert. Des Weiteren wurden sie bezüglich ihres metabolischen Profils auf proteolytische Aktivität, sowie Stärkeabbau getestet und mittels api® 50CH Test weiter charakterisiert. Die getesteten potentiellen Starterkulturen bildeten in mMRS5-Boullion Mannitol, jedoch nicht in den fermentierten Pseudozerealien. Sie bildeten weiterhin bis zu 214 mM Milchsäure. Bei keinem der Stämme wurden erhöhte proteolytische Aktivitäten im Teig oder amylolytische Eigenschaften nachgewiesen. In Bezug zu den getesteten Parametern zeigten die eingesetzten potentiellen Starterkulturen ähnliche Eigenschaften wie kommerziell erhältliche. Sie produzierten sogar bis zu 48 mM mehr Laktat. Die Stämme sind stabil gegenüber schwankenden Fermentationstemperaturen. Sogar unter suboptimalen Bedingungen, bei einer Temperaturerniedrigung um 5°C, erzielte die Mehrstammstarterkultur vergleichbare Fermentationscharakteristika wie die kommerziell erhältliche Mehrstammstarterkultur IS1 unter optimalen Fermentations-parametern (30°C). Beispielsweise wurde bei 25°C durch die Kombination beider Stämme noch 20 mM mehr Laktat gebildet, als bei einem bei 30°C geführten Amaranth-Teig, der mit IS1 inokuliert wurde. Abschließend betrachtet erfüllen die analysierten Stämme aus mikrobiologischer Sicht alle wichtigen Anforderungen an eine Sauerteigstarterkultur. Sie zeigten sich kompetitiv und stabil im Fermentationsverhalten und sind interessante Kandidaten für den Einsatz in Sauerteigen.